Investigation of carbon monoxide binding to vanadium nitrogenase

Abstract: Die Entwicklung der modernen Gesellschaft profitiert in hohem Maße von etablierten industriellen Verfahren des letzten Jahrhunderts. Viele Anwendungen der chemischen Industrie wirken sich jedoch zunehmend auf das globale Ökosystem aus, und biotechnologische Ansätze, die diese Prozesse auf umweltfreundliche Weise ersetzen können, sind erstrebenswert. Das Metalloenzym Nitrogenase kann auf einzigartige Weise atmosphärischen Stickstoff unter milden Bedingungen in bioverfügbaren Ammoniak spalten, während die analoge Reaktion im industriellen Haber-Bosch-Verfahren unter hohem energetischen Aufwand durchgeführt wird, um die globale Nachfrage für die Nahrungsmittelproduktion zu decken. Das Enzym setzt dazu am aktiven Zentrum einen komplexen Cofaktor ein, der Molybdän, sieben Eisen, neun Sulfide und ein zentrales Carbid enthält. Verschiedene Varianten der Nitrogenase wurden untersucht, wobei die molybdänabhängige Variante seit vielen Jahrzehnten im Zentrum der Forschung stand. Trotz großer Anstrengungen bleibt der Mechanismus der Nitrogenase immer noch ungeklärt. Eine Variante des Enzyms, die Molybdän durch Vanadium ersetzt, besitzt zusätzlich die Fähigkeit, Kohlenmonoxid in Kohlenwasserstoffe umzuwandeln. Dieser Reaktionspfad ist wenig erforscht, trotz seiner Bedeutung als Äquivalent zum industriellen Fischer-Tropsch-Verfahren.
In dieser Arbeit wurde das aktive Zentrum der Vanadium-Nitrogenase mittels Röntgenkristallographie untersucht. Die Enzymkatalyse wurde mit den Substraten Distickstoff (N₂), Acetylen (C₂H₂), Cyanid (CN⁻) und Kohlenmonoxid (CO) oder in Abwesenheit von Substrat durchgeführt. Während die meisten Substrate nicht an das aktive Zentrum gebunden werden konnten, akkumulierte in Abwesenheit von Substrat ein Zustand, in dem ein Sulfid durch OH⁻ an der binukleären Bindestelle zwischen Fe2 und Fe6 des Cofaktors ersetzt wurde.
Die sequenzielle und reversible Bindung von zwei CO-Liganden konnte am aktiven Zentrum der Vanadium-Nitrogenase beobachtet werden. COᴬ wurde als µ₂-Brücke zwischen Fe2 und Fe6 des aktiven Zentrums nach der Katalyse gefunden. Der nach CO-Umsetzung erhaltene Cofaktor wies zudem die besondere Fähigkeit auf, einen zusätzlichen Liganden, COᴮ, unter CO-Druck terminal an Fe6 zu binden. Andere Substrate konnten nicht unter Druck gebunden werden. Beide CO-Liganden wurden mittels Röntgenkristallographie und IR-Spektroskopie charakterisiert. Die erhaltenen experimentellen Daten ermöglichten die Formulierung eines Vorschlags für den Mechanismus der CO-Reduktion am Cofaktor. Zusätzlich wurden strukturelle Veränderungen an den Seitenketten Gln-176 und Lys-361 festgestellt, die das Potential für zukünftige Mutationsstudien zur Optimierung der Produkte aus der CO-Reduktion bergen.
Die gefundenen Bindestellen für CO geben einen Hinweis auf relevante Metalle des Cofaktors, welche auch an der Stabilisierung von Intermediaten bei der N₂-Reduktion beteiligt sein könnten. Dies kann in der Zukunft zur Aufklärung des Mechanismus der N₂-Reduktion von Nitrogenasen genutzt werden
Abstract: The development of modern society benefits greatly from established industrial processes of the last century. However, many techniques of the chemical industry are increasingly impacting the global ecosystem and biotechnological solutions that can supplant these processes in an environmentally friendly manner are highly desirable. The metalloenzyme nitrogenase can uniquely break atmospheric dinitrogen into bioavailable ammonia under mild conditions, while the equivalent reaction in the industrial Haber-Bosch process is carried at high energetic costs to meet global demand for food production. The enzyme employs a complex cofactor at the active site that contains molybdenum, seven irons, nine sulfides and a central carbide. Different variants of this enzyme have been investigated, and the molybdenum-dependent variant has remained at the center of research for many decades. Despite extensive efforts, the mechanism of nitrogenase still remains enigmatic. A variant of the enzyme employs vanadium in place of molybdenum and additionally possesses the ability to transform carbon monoxide into hydrocarbons. This reaction pathway is less explored, despite its significance as an equivalent to the industrial Fischer-Tropsch process.

In this work, the active site of vanadium nitrogenase was investigated by X-ray crystallography. Turnover assays were conducted with the substrates dinitrogen (N₂), acetylene (C₂H₂), cyanide (CN⁻) and carbon monoxide (CO) or without substrate. While most substrates were not successfully bound at the active site, the absence of substrates during turnover accumulated a state in which OH⁻ replaced a sulfide at a binuclear site between Fe2 and Fe6 of the cofactor.
The sequential and reversible binding of two CO ligands was observed at the active site of vanadium nitrogenase. COᴬ was bound as µ₂-bridge between Fe2 and Fe6 of the active site during turnover. The obtained cofactor after CO-turnover also exhibited the ability to bind an additional ligand, COᴮ, terminally to Fe6 under CO pressure. Other substrates could not be bound under gas pressure. Both CO ligands were characterized via X-ray crystallography and IR spectroscopy. The obtained experimental data allowed the proposal of a reaction scheme for CO-reduction at the cofactor. Additionally, structural changes were observed at residues Gln-176 and Lys-361 that bear potential for future mutational studies to optimize the product profile of CO-reduction by nitrogenases.

The identified CO binding sites indicate relevant metals of the cofactor that most likely are also involved in the stabilization of intermediates during N₂-reduction. This can be used to elucidate the mechanism of N₂-reduction by nitrogenases in the future

Object Details

• Location: Deutsche Nationalbibliothek Frankfurt am Main
• Extent: Online-Ressource
• Language: Englisch
• Notes: Universität Freiburg, Dissertation, 2020

Classification and Topics

• Keyword: Stickstofffixierung ; Proteine ; Nitrogenase ; Nitrogenase ; Kohlenmonoxid ; Fischer-Tropsch-Synthese ; Stickstofffixierung ; Röntgenbeugung ; Infrarotspektroskopie

Contributors, Places and Time

• Event: Veröffentlichung
• (where): Freiburg
• (who): Universität
• (when): 2021
• Creator: Rohde, Michael
• Contributor: Einsle, Oliver ; Albert-Ludwigs-Universität Freiburg. Fakultät für Chemie und Pharmazie

Further information

• DOI: 10.6094/UNIFR/175485
• URN: urn:nbn:de:bsz:25-freidok-1754854
• Rights: Open Access; Der Zugriff auf das Objekt ist unbeschränkt möglich.
• Last update: 25.03.2025, 1:51 PM CET