Structural and functional characterization of the Na+-translocating NADH:quinone oxidoreductase from Vibrio cholerae and YihU of the sulfoglycolysis pathway : = Strukturelle und funktionelle Charakterisierung der Na+-translozierenden NADH:Ubichinon Oxidoreduktase aus Vibrio cholerae und YihU des Sulfoglycolysis-Stoffwechselweges

Hochschulschrift

Zusammenfassung: The Na+-translocating NADH:quinone oxidoreductase, Na+-NQR, is a central respiratory enzyme of many pathogenic bacteria. Na+-NQR consists of six subunits called NqrA-NqrF and has a total molecular mass of 220 kDa. The function of Na+-NQR is similar to the one of complex I. It couples electron transfer from NADH to quinone with translocation of ions across the membrane to buildup a electrochemical gradient. However, Na+-NQR and complex I differ with respect to subunit number, cofactors bound, occurrence in organisms, and translocated ion. Complex I translocates H+, whereas the Na+-NQR pumps Na+. The Na+-NQR plays a central role in the sodium bioenergetics of many pathogenic bacteria, because the Na+ gradient is used for several important cellular processes; e.g. the movement of the flagellum and intake of nutrients are driven by the Na+ gradient. Moreover, Na+-NQR is linked to virulence gene expression in Vibrio cholerae. The fact that Na+-NQR is only found in prokaryotes makes it an ideal target for the development of new antibiotics. However, the exact reaction mechanism of the Na+-NQR is still unknown. In addition, there exists no published structural information about the whole complex that could help to better understand this enzyme. The main subject of the work was to improve the preliminary low resolution structural data of the entire Na+-NQR complex from V. cholerae, which were obtained within our group previously. For this, protein expression and purification protocols had to be optimized or newly established for the peripheric subunits NqrA and NqrC. Afterwards, these subunits were crystallized and the structures were determined at resolutions of 1.9 Å for NqrA and 1.7 Å for NqrC. The structure of NqrA revealed it as the first subunit of Na+-NQR that shares structural similarity to a subunit from complex I, Nqo1 from Thermus thermophilus. This was unexpected, because both subunits only have a low sequence identity. In addition, the structure of the NqrA indicates that Na+-NQR might have evolved from the Rhodobacter nitrogen fixation (RNF) complex. The structure of holo-NqrC is not similar to any known protein in the protein data bank except a homologue structure of apo-NqrC from Parabacteroides distasonis. NqrC contains a FMN that is covalently bound to Thr225 by a phosphoester bond and FMN located at the surface of the protein. The isoalloxazine moiety is oriented in the binding site in such a way that the C7 and C8 methyl groups are sticking out of the protein matrix. This might be essential for fast electron transfer. The high-resolution structures of NqrA and NqrC were used to complement the low-resolution structure of the entire complex, in which the electron density for the peripheric subunits was weak. In addition, the resolution of the Na+-NQR was improved from 3.5 to 3.2 Å by crystal optimization. The here presented structure of the Na+-NQR reveals several so far unknown features of the enzyme. The peripheric NqrC is located in the periplasm and not in the cytoplasm. A previously uncharacterized Fe within the membrane was found that is required for electron transfer across the membrane. Knowing the positions of the redox cofactors it was possible to predict an electron transfer pathway. A hypothesis how the Na+-translocation might be coupled to the electron transfer was suggested. However, even with the structural information present, the binding site of the terminal electron acceptor ubiquinone-8 still remains unknown. Through soaking of crystals from Na+-NQR the binding site of the inhibitor 2,5-dibromo-3-methyl-6-isopropyl-p-benzoquinone (DBMIB) was located at NqrB. It remains to be shown, whether this binding site represents the site of inhibition. In a second project YihU was structurally investigated. The reductase YihU of E. coli is part of the recently characterized sulfoglycolysis pathway, in which sulfoquinovose is degraded. Sulfoquinovose is the headgroup of sulfolipids found in plants, algae, and photosynthetic bacteria. YihU catalyzes the reduction of 3-sulfolactaldehyde to 2,3-dihydroxypropane-1-sulfonate (DHPS) under usage of NADH. DHPS is then used as a carbon source by other bacteria e.g. Cupriavidus pinatubonensi JMP134, which leads to a release of sulfate and thus closes the biological sulfur cycle. A protein expression and purification protocol was established for YihU. The protein was crystallized and the preliminary structure was determined at 1.3 Å. YihU forms a homodimer and is characterized by extensive domain swapping at the C-terminus. The domain swapping might be important for the regulation of the protein because it is occurring in close proximity to the proposed active site of the enzyme.
Zusammenfassung: Die Na+ translozierende NADH:Ubichinon Oxidoreduktase, kurz Na+-NQR, ist ein zentrales Enzym in der Atmungskette zahlreicher pathogener Bakterien. Die Na+-NQR besteht aus sechs Untereinheiten, die NqrA-F genannt werden. Sie hat eine molekulare Masse von 220 kDa. Die Funktion der Na+-NQR ist vergleichbar mit der von Komplex I. Der Elektronentransfer von NADH zu Ubichinon ist mit dem Aufbau eines Ionengradienten über die Membran gekoppelt. Na+-NQR und Komplex I unterscheiden sich jedoch in einigen zentralen Aspekten, wie z.B. in der Anzahl der Untereinheiten, der Art der Kofaktoren, dem Vorkommen in Organismen und darin, welches Ion transloziert wird. Komplex I transloziert H+, während es Na+ in der NQR sind. Na+-NQR ist von zentraler Bedeutung für die Na+-Bioenergetik von zahlreichen pathogenen Bakterien, da der Natriumionen-Gradient für verschiedene zelluläre Prozesse genutzt wird. So z.B. für die Bewegung des Flagellum sowie für die Aufnahme von Nährstoffen. Weiterhin beeinflusst der Na+ Gradient die Expression der Virulenzgene in Vibrio cholerae. Da die Na+-NQR nur in Prokaryoten vorhanden ist, stellt das Enzym ein neues, interessantes Target für die Entwicklung neuer Antibiotika, dar. Allerdings ist der genaue Reaktionsmechanismus der Na+-NQR noch unbekannt. Zudem ist derzeit noch keine Struktur von Na+-NQR publiziert, die dabei helfen könnte, das Protein besser zu verstehen. Das zentrale Thema dieser Arbeit war, die vorhandene niedrig aufgelöste Struktur des Gesamtkomplexes, welche zu einem früheren Zeitpunkt erhalten wurde, zu verbessern. Hierfür wurden für die peripheren Untereinheiten NqrA und NqrC die Proteinexpressions- und Aufreinigungsprotokolle weiter optimiert und neu etabliert. Diese Untereinheiten wurden kristallisiert und die Strukturen wurden mit einer Auflösung von 1,9 Å für NqrA sowie von 1,7 Å für NqrC gelöst. Die Struktur zeigte, dass NqrA eine strukturelle Ähnlichkeit mit Nqo1 besitzt, die eine Untereinheit von Komplex I aus Thermus thermophilus ist. Diese Ähnlichkeit war unerwartet, da die beiden Proteine eine nur sehr niedrige Sequenzidentität besitzen. Zudem ist dies der einzig bekannte Fall von struktureller Ähnlichkeit von Untereinheiten aus Komplex I und Na+-NQR. Die Struktur der NqrA liefert Indizien für eine potenziell evolutionäre Herkunft von Na+-NQR aus dem RNF Komplex. Die Struktur von NqrC aus Vibrio cholerae, zeigt strukturelle Ähnlichkeit mit dem homologen Protein aus Parabacteroides distasonis, aber keine strukturelle Ähnlichkeit mit anderen Proteinstrukturen in der PDB. Das kovalent gebundene FMN, das sich an der Oberfläche des Proteins befindet, sitzt derart in der Bindetasche, dass die Methylgruppen an C7 und C8, die für den Elektronentransfer von Bedeutung sind, aus der Proteinmatrix herausragen. Diese hoch aufgelösten Strukturen von NqrA und NqrC wurden verwendet, um die Struktur der NQR bei niedriger Auflösung zu verbessern. Die Elektronendichte dieser periphären Untereinheiten schwach war bislang nur sehr schwach und schwer zu modellieren. Außerdem wurde die Auflösung des Gesamtkomplexes durch Kristalloptimierung von 3,5 auf 3,2 Å verbessert. Die hier präsentierte Struktur der Na+-NQR zeigt mehrere bisher unbekannte Eigenschaften auf. Die periphere NqrC befindet sich im Periplasma und nicht im Cytoplasma. Es wurde ein bisher unbekanntes Fe in der Membran entdeckt, das für den Elektronentransfer über die Membran notwendig ist. Durch die Bestimmung der genauen Position der Kofaktoren wurde es möglich eine Hypothese zur Kopplung der Na+ Translokation an den Elektronentransfer zu formulieren. Die Struktur gab jedoch bislang keine Auskunft über die Bindestelle von Ubichinon-8 des letzten Elektronenakzeptors in Na+-NQR. Die Bindestelle für den Inhibitor DBMIB wurde über Soaking Experimente an den Untereinheiten NqrB und NqrD lokalisiert. Ob diese Bindestelle auch den Ort der Inhibition darstellt ist noch unklar. In dem zweiten Projekt ging es um die Reduktase YihU aus E. coli, welche Teil des unlängst entdeckten Sulfoglycolysis-Stoffwechselweges ist, in dem Sulfoquinovose abgebaut wird. Sulfoquinovose ist die Kopfgruppe von Sulfolipiden, die in Pflanzen, Algen und photosynthetischen Bakterien vorhanden sind. YihU katalysiert die Reduktion von Glycerinaldehyd-3-sulfonat zu 2,3-Dihydroxypropan-1-sulfonat (DHPS) unter dem Verbrauch von NADH. DHPS wird dann von anderen Bakterien als Energiequelle genutzt, z.B. von Cupriavidus pinatubonensi JMP134. Schlussendlich wird Sulfat freigesetzt und so eine Lücke im biologischen Schwefelkreislauf schließt. Es wurde ein Proteinexpressions- und Aufreinigungsprotokoll für YihU entwickelt. YihU wurde kristallisiert sowie die vorläufige Struktur bei einer Auflösung von 1,3 Å gelöst. YihU besteht aus einem Dimer, welches durch einen intensiven Domänenaustausch zwischen den Monomeren charakterisiert ist. Der Domänenaustausch könnte möglicherweise wichtig für die Regulation der katalytischen Aktivität sein, da sich in der Nähe das aktive Zentrum des Enzyms befindet.

Angaben zum Objekt

• Weitere Titel: Strukturelle und funktionelle Charakterisierung der Na+-translozierenden NADH:Ubichinon Oxidoreduktase aus Vibrio cholerae und YihU des Sulfoglycolysis-Stoffwechselweges
• Standort: Deutsche Nationalbibliothek Frankfurt am Main
• Umfang: Online-Ressource
• Sprache: Englisch
• Anmerkungen: Universität Freiburg, Dissertation, 2014

Klassifikation und Themen

• Klassifikation: Biowissenschaften, Biologie
• Schlagwort: NADH-Dehydrogenase ; Vibrio cholerae ; Atmungskette ; Kristallographie ; Online-Ressource

Beteiligte, Orts- und Zeitangaben

• Ereignis: Veröffentlichung
• (wo): Freiburg
• (wer): Universität
• (wann): 2014
• Urheber: Vohl, Georg
• Beteiligte Personen und Organisationen: Einsle, Oliver

Weitere Informationen

• URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-97762
• Rechteinformation: Der Zugriff auf das Objekt ist unbeschränkt möglich.
• Letzte Aktualisierung: 25.03.2025, 13:45 MEZ