The Iron-only nitrogenase system of Azotobacter vinelandii

Abstract: Das Leben auf der Erde ist streng abhängig vom Vorhandensein der fünf Elemente Kohlenstoff, Sauerstoff, Wasserstoff, Stickstoff und Schwefel, die die wesentliche Bestandteile der verschiedenen biologischen Bausteine wie zum Beispiel Aminosäuren, Nukleinsäuren oder Kohlenhydrate darstellen. Während Stickstoff das mit Abstand häufigste Element in der Erdatmosphäre ist, führt die Inertheit des elementaren Stickstoffmoleküls, die auf die außerordentlich starke Dreifachbindung zurückzuführen ist, zu einer ständigen Knappheit an leicht zugänglichen Stickstoffquellen. Andererseits werden heute, nicht zuletzt dank des extrem energieintensiven industriellen Haber-Bosch-Verfahren zur großtechnischen Ammoniaksynthese, zu große Mengen an Stickstoffverbindungen unter anderem als Düngemittel in die Umwelt abgegeben, was letztlich unter Anderem zum Problem von erhöhten Nitratpegeln und damit einer Belastung des Grundwassers führt. Im Gegensatz zum industriellen Pendant erfolgt die durch das Enzym Nitrogenase katalysierte biologische Stickstofffixierung bei Umgebungsbedingungen, wobei komplexe Regulationsmechanismen der diazotroph wachsenden Organismen die übermäßige Freisetzung von Ammonium in die Umwelt verhindern. Während einige Forschungsgruppen daran arbeiten, Pflanzen gentechnisch die entsprechenden Gene zur Stickstofffixierung einzuschleusen, streben andere Gruppen die Optimierung bereits bestehender Katalysatoren anhand der Nitrogenase an. Die Entwicklung naturinspirierter Katalysatoren erfordert jedoch ein gründliches Verständnis der biologischen Systeme.
Bisher wurden in der Natur drei verschiedene Nitrogenase-Isozyme identifiziert, die entweder Molybdän-, Vanadium- oder nur Eisen-abhängig sind. Während alle drei Nitrogenasen in der Lage sind Stickstoff zu reduzieren – wobei das Mo-Isozym zweifellos die höchsten Reduktionsraten zeigt, wurde interessanterweise festgestellt, dass die alternativen V- und Fe-nitrogenasen auch Reaktionen katalysieren die analog zum Fischer-Tropsch- bzw. Sabatier-Prozess sind. Obwohl nun bereits seit einigen Jahren Strukturen für die Mo- und V-Nitrogenase verfügbar sind und bemerkenswerte Unterschiede in den entsprechenden aktiven Zentren aufgezeigt haben, so bleibt der Grund für das unterschiedliche katalytische Verhalten bis heute rätselhaft. Darüber hinaus wurden bisher für das am wenigsten verstandene Fe-Nitrogenase System keinerlei strukturelle Informationen veröffentlicht, wodurch ein Vergleich der aktiven Zentren der drei Systeme verwehrt bleibt.
Aus diesem Grund wurden im Rahmen dieser Arbeit die Proteine des Nur-Fe-Nitrogenase Systems aus Azotobacter vinelandii – einem häufig verwendeten diazotrophen Modellorganismus, der alle drei Nitrogenase-Systeme beherbergt – isoliert und durch Röntgenkristallographie strukturell charakterisiert. Die Struktur der Reduktase-Komponente AnfH wurde dabei sowohl in der der ADP-gebundenen als auch in einem nukleotidfreien Zustand erhalten und weist eine große Ähnlichkeit mit den homologen Fe-Proteinen NifH bzw. VnfH der Mo- und V-abhängigen Systeme auf. Interessanterweise zeigten Aktivitätsmessungen, bei denen die drei homologen Fe-Proteine mit jeder der drei Nitrogenasen in individuellen Ansätzen kombiniert wurde, dass die Vanadium-Nitrogenase mit allen drei Fe-Proteinen kompatibel ist, während die Nur-Fe-Nitrogenase nur mit AnfH funktionsfähig ist. Darüber hinaus konnte mit der erstmaligen Strukturaufklärung der Fe Nitrogenase gezeigt werden, dass auch in dem am wenigsten verstandenen Nitrogenase-System dieselbe Kofaktorarchitektur wie in den katalytischen Clustern der anderen Nitrogenasen vorherrscht und dass auch FeFe-co über einen Homocitrat-Liganden verfügt. Der wohl wichtigste Punkt in Bezug auf die in dieser Arbeit erhaltene Struktur ist jedoch der Befund, dass die für den FeV-co berichtete Konformationsänderung des hochkonservierten Aminosäurerestes Gln176 am aktiven Zentrum, die mutmaßlich mit dem Vorhandensein des Kofaktors in einem Nichtruhezustand in Verbindung steht, nun auch für das katalytische Zentrum der Fe-Nitrogenase beobachtet wird und damit einen weiteren Hinweis auf einen gemeinsamen Reaktionsmechanismus aller drei Nitrogenasen liefert
Abstract: Life on Earth is strictly dependent on the five elements, carbon, oxygen, hydrogen, nitrogen, and sulfur as essential parts of the various biological building blocks, such as amino acids, nucleic acids, or carbohydrates. On the one hand, while nitrogen is the most abundant element in Earth’s atmosphere, the inertness of the dinitrogen molecule, which is due to the extraordinarily strong triple bond, leads to a constant scarcity of easily accessible nitrogen sources. On the other hand, today, not least thanks to the extremely energy-intensive industrial Haber-Bosch process for the production of ammonia, too large quantities of nitrogen compounds are released into the environment as fertilizer, which ultimately leads to the problem of increased nitrate levels in the groundwater. In contrast to its industrial counterpart, biological nitrogen fixation catalyzed by the enzyme nitrogenase is realized at ambient conditions, with complex regulatory mechanisms of the diazotrophically growing organisms preventing the excess release of ammonium into the environment. While some research groups are working on introducing the appropriate genes directly into plants to enable them to fix nitrogen, there are others who are striving to optimize existing catalysts using nitrogenase as a template. However, the development of nature-inspired catalysts requires a thorough understanding of biological systems.
To date, three different nitrogenase isozymes have been identified in nature, which are either molybdenum-, vanadium- or just iron-dependent. Interestingly, while all three nitrogenases are capable of nitrogen reduction – with the Mo isozyme undoubtedly showing the highest reduction rates, the so-called alternative V-and Fe-nitrogenases have also been found to catalyze Fischer-Tropsch-or Sabatier-like chemistry. Although structures for the Mo- and V-nitrogenases have been available for several years now, revealing remarkable differences in the corresponding active sites, the reason for the different catalytic behavior remains enigmatic. In addition, no structural information has been published for the least understood Fe-nitrogenase system, preventing a comparison of the active sites of the three systems.
For this reason, in this work, the component proteins of the Fe-only nitrogenase system from Azotobacter vinelandii – a commonly used diazotrophic model organisms harboring all three nitrogenase systems – were isolated and structurally characterized by X-ray crystallography. The structure of the reductase component AnfH was obtained in an ADP-bound as well as in a nucleotide-free state, showing a high degree of similarity compared to the Fe protein homologs of the Mo-and V-dependent systems, NifH and VnfH, respectively. Interestingly, activity measurements, combining the three Fe protein homologs with each of the three nitrogenases in individual set-ups was showing that vanadium nitrogenase is compatible with all three Fe proteins in contrast to the Fe-only nitrogenase that is only functional with AnfH.
In addition, with the first structural elucidation of an Fe-only nitrogenase, it could be shown that even in the least understood nitrogenase system, the same cofactor architecture prevails and that FeFe-co, like the other nitrogenase cofactors, also has a homocitrate ligand. However, arguably the most important point regarding the structure obtained in this work is the finding, that the conformational change of active site residue Gln176 reported for the non-active state conformation in VFe-co, is also observed in the catalytic cofactor of the Fe-nitrogenase. However, arguably the most important point regarding the structure obtained in this work is the finding that the conformational change of active site residue Gln176 reported for the non-active state conformation in FeV-co is also observed in the catalytic center of the Fe nitrogenase and thus provides an indication of a reaction mechanism used jointly by all three nitrogenases

Angaben zum Objekt

• Standort: Deutsche Nationalbibliothek Frankfurt am Main
• Umfang: Online-Ressource
• Anmerkungen: Universität Freiburg, Dissertation, 2022

Klassifikation und Themen

• Klassifikation: Biowissenschaften, Biologie
• Schlagwort: Stickstofffixierung ; Nitrogenase ; Strukturbiologie ; Stickstofffixierung ; Azotobacter vinelandii

Beteiligte, Orts- und Zeitangaben

• Ereignis: Veröffentlichung
• (wo): Freiburg
• (wer): Universität
• (wann): 2023
• Urheber: Trncik, Christian
• Beteiligte Personen und Organisationen: Einsle, Oliver ; Einsle, Oliver ; Andrade, Susana ; Albert-Ludwigs-Universität Freiburg. Institut für Biochemie ; Albert-Ludwigs-Universität Freiburg. Fakultät für Chemie und Pharmazie

Weitere Informationen

• DOI: 10.6094/UNIFR/233352
• URN: urn:nbn:de:bsz:25-freidok-2333522
• Rechteinformation: Open Access; Der Zugriff auf das Objekt ist unbeschränkt möglich.
• Letzte Aktualisierung: 25.03.2025, 13:56 MEZ