Resolving protein dynamics by single-molecule fluorescence and neutron scattering

Abstract: Unsere Vorstellung über die Funktion der Proteine wurde maßgeblich durch eindrückliche Fortschritte der Strukturbiologie geprägt. Dass Proteine kommunizieren und interagieren können, beruht jedoch letzten Endes auf ihrer Dynamik. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, ein umfassendes dynamisches Bild eines Chaperons, des Hitzeschockproteins 90 (Hsp90), zu erarbeiten. Als „molekulare Anstandsdame“ sorgt Hsp90 für die korrekte Faltung anderer Proteine und ist dadurch zum Hoffnungsträger geworden, Krankheiten, wie Alzheimer und Krebs, therapieren zu können.

Durch die Kombination komplementärer Messtechniken wie konfokaler Einzelmolekülfluoreszenz und Quasielastischer Neutronenstreuung („QENS“) konnten die Bewegungen von Hsp90 auf einer Zeitskala von mehreren Pikosekunden bis zu einigen Millisekunden bestimmt werden. Eine auf Einzelmolekül-FRET basierte Wahrscheinlichkeitsverteilungsanalyse („PDA“) ergab eine gute Beschreibung des Hsp90-Systems durch drei Konformationszustände: durch einen offenen und zwei geschlossene Zustände („A“ und „B“). Während Zustand „A“ konsistent mit bestehenden Röngtenkristallstrukturdaten war, konnte basierend auf „B“ eine neue Hsp90-Konformation postuliert werden. Fluoreszenzlebenszeitexperimente und FRET-FCSMessungen ergaben, dass ein Konformationswechsel zwischen „A“ und „B“ Dynamiken von etwa 0.1-10 ms involvierte. Um Proteindynamik von potenzieller Farbstoff-Photophysik unterscheiden zu können, wurden die Signaturen des „Photon-Antibunchings“ und der Tripletkinetik der verwendeten Fluoreszenzmarker (Atto532, Atto550 und Atto647N) identifiziert. Zudem wurde die Fluorophor-Tryptophan-Wechselwirkung systematisch untersucht. Mittels Nanosekunden-Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie (nsFCS) konnte für Hsp90 eine Korrelationszeit von etwa 100 ns detektiert werden. Zu ihrer weiteren Charakterisierung wurden zeitaufgelöste Anisotropie-Messungen durchgeführt. In guter Übereinstimmung mit Molekulardynamik-Simulationen konnte so die Rotationsdynamik und eine interne Dynamik auf der Zeitskala von 70-100 ns
quantifiziert werden. Gestützt wurde die Dateninterpretation durch QENS-Experimente, welche markerfrei und nicht-destruktiv sowohl die globale als auch die interne Proteindynamik nachwiesen. Um das Potenzial der nsFCS-Methode zu erfassen, wurde Hsp90 zusätzlich mit Helferproteinen gemessen. Diese Daten
ergaben einen ersten Hinweis, dass Co-chaperone die Nanosekundendynamik von Hsp90 modulieren können und, dass die nsFCS-Methode in der Lage ist, Proteininterkationen weit unter der Dissoziationskonstante
nachzuweisen.

Die gewonnenen Erkenntnisse erlaubten der Frage nachzugehen, wie Proteinregulierung auf biomolekularer Ebene stattfindet. In Kombination mit Molekulardynamik-Ergebnissen konnte ein allosterischer Kommunikationspfad aufgeklärt werden, welcher, durch die ATP-Hydrolyse ausgelöst, zu großen
Konformationsänderungen von Hsp90 führt. Ferner wird ein einfacher Mechanismus vorgeschlagen, wie Proteinregulation auf der Nanosekundenzeitskala ablaufen könnte. Im Ganzen könnte die Arbeit eine
Paradigmenerweiterung anstoßen: vom „Struktur-Funktion“-geleiteten Denken hin zum „Dynamik-Funktion“-orientierten Denken. Darüber hinaus ermutigt sie zukünftige interdisziplinäre Ansätze zur Aufklärung fundamentaler Fragestellungen
Abstract: Our current understanding of protein function is largely based on the impressive progress in structural biology. However, the ability of proteins to communicate and to interact is based on their dynamics. The aim of this work was to elaborate a comprehensive dynamic picture of a chaperone, the heat shock protein 90 (Hsp90). As a chaperone, Hsp90 is responsible for correct folding of other proteins which made it a bearer of hope to treat diseases such as Alzheimer and cancer.

Dynamics from several picoseconds to milliseconds were characterised by combining complementary experimental techniques, such as confocal single-molecule fluorescence and quasi-elastic neutron scattering (QENS). A single-molecule FRET-based probability distribution analysis (PDA) revealed an open and two closed conformational states (“A” and “B”). While state “A” was consistent with existing x-ray data, based on “B”, a new Hsp90 conformation was postulated. Transitions between “A” and “B” involved dynamics from ~0.1ms to ~10ms, as determined by fluorescence lifetime and FRET-FCS experiments. To differentiate between protein dynamics and dye photophysics, the signatures of antibunching and triplet kinetics of the dyes used (Atto532, Atto550, Atto647N) were identified. In addition, the tryptophan-dye interaction was investigated systematically. This way, in Hsp90 a correlation on the order of ~100 ns was detected by nanosecond fluorescence correlation spectroscopy (nsFCS). Complementary, time-resolved anisotropy measurements were performed to determine rotational correlations. As a result, in good agreement with MD simulations, rotational and internal dynamics on the 70-100 ns time scale could be quantified. The interpretation was supported by QENS experiments, which revealed global and internal dynamics label-free and non-destructively. To evaluate the potential of nsFCS, Hsp90 was measured with co-chaperones. These data provided a first hint that co-chaperones can modulate Hsp90 on the nanosecond timescale and showed that nsFCS is capable to detect protein interactions far below the dissociation constant.

The presented findings allowed us to address the question of how protein regulation occurs on the biomolecular level. An allosteric communication pathway from ATP-hydrolysis to large conformational changes of Hsp90 was elucidated in combination with MD simulations. Furthermore, a mechanism is suggested, how protein regulation could occur on the nanosecond time scale. In sum, this work motivates to extend the paradigm: From “structure-function”-guided towards “dynamics-function”-oriented thinking. Moreover, this work encourages future interdisciplinary approaches to shed light on fundamental scientific questions

Angaben zum Objekt

• Standort: Deutsche Nationalbibliothek Frankfurt am Main
• Umfang: Online-Ressource
• Sprache: Englisch
• Anmerkungen: Universität Freiburg, Dissertation, 2021

Klassifikation und Themen

• Schlagwort: Einzelmolekülspektroskopie ; Proteine ; Neutronenstreuung ; Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie ; Konformationsänderung

Beteiligte, Orts- und Zeitangaben

• Ereignis: Veröffentlichung
• (wo): Freiburg
• (wer): Universität
• (wann): 2021
• Urheber: Sohmen, Benedikt
• Beteiligte Personen und Organisationen: Hugel, Thorsten ; Albert-Ludwigs-Universität Freiburg. Fakultät für Chemie und Pharmazie

Weitere Informationen

• DOI: 10.6094/UNIFR/222199
• URN: urn:nbn:de:bsz:25-freidok-2221999
• Rechteinformation: Open Access; Der Zugriff auf das Objekt ist unbeschränkt möglich.
• Letzte Aktualisierung: 25.03.2025, 13:42 MEZ