Dissociation kinetics of protein complexes measured with a microfluidic fast dilution mixer on a confocal microscope using pulsed interleaved excitation : = Dissoziationskinetiken von Proteinkomplexen gemessen mit schnellen Mikrofluidik-Mixern auf einem konfokalen Mikroskop mit alternierend gepulster Anregung

Abstract: Although methods to investigate protein binding kinetics like isothermal titration calorimetry (ITC) and surface plasmon systems (OpenSPR, Nicoya) already exist, these methods usually require large amounts of protein. In this work, methods for a single molecule study of protein binding kinetics are established. Single molecule measurements usually require only a fraction of the sample volume needed for other methods as measurements are commonly done in picomolar concentrations with a sample volume of only a few μL. In this study I developed theory, measurement and analysis methods to measure the dissociation of fluorescence-labelled protein complexes by means of microfluidic fast dilution on a confocal microscope employing a pulsed interleaved excitation (PIE) scheme to investigate Förster resonance energy transfer (FRET). A small volume of highly concentrated (micromolar, 5−50 μL) protein complex is rapidly diluted within a few ms to single molecule concentration before dissociation starts. The dissociation can then be followed by the decrease of a FRET-population over time in the histogram of label stoichiometry. Not only the dissociation rate can be extracted, but also the dissociation constant KD and thus the association rate as well. The theory, measurement and analysis methods developed in this work are implemented in a new Matlab software package. Applied to systems with homodimer and heterodimer dissociation these methods reveal new insights in the mechanics of Hsp90
Abstract: Es existieren bereits Methoden wie Isotherme Titrationskalorimetrie (ITC) oder Systeme, die Oberflächenplasmonen nutzen (OpenSPR, Nicoya), um Bindungskinetiken von Proteinen zu messen. Allerdings benötigt man für diese Messungen in der Regel große Proteinmengen. Diese Arbeit zeigt neue Einzelmolkülmethoden zur Untersuchung von Protein-Bindungskinetiken auf. Einzelmolkülmessungen werden üblicherweise mit Proben von einigen μL im picomolaren Bereich durchgeführt. Ein zentraler Fokus dieser Arbeit liegt auf der Messung des Dissoziationsvorgangs von fluoreszenzmarkierten Proteinkomplexen mithilfe von schnell verdünnenden Mikrofluidik-Mixern. Dazu wurden von mir Theorie, Messmethoden und Analysemethoden entwickelt. Die Dissoziation der Komplexe wird mit einem konfokalen Mikroskop beobachtet, auf dem durch alternierende Laserpulse (PIE) Förster-Resonanzenergietransfer gemessen wird. Ein kleines Volumen an hochkonzentrierter Lösung eines Proteinkomplexes (mikromolare Konzentration, 5 − 50 μL) wird innerhalb einiger weniger ms auf Einzelmolekülkonzentration verdünnt, sodass Messungen noch vor Einsetzen der Dissoziation getätigt werden können. Der Dissoziationsvorgang selbst kann dann anhand einer abnehmenden FRET-Population in der Label-Stöchiometrie verfolgt werden. Dabei kann nicht nur die Dissoziationsrate, sondern zusätzlich auch die Gleichgewichtskonstante KD und damit die Assoziationsrate bestimmt werden. In dieser Arbeit werden die Theorie, neue Mess- und Analysemethoden zu Messungen dieser Art vorgestellt. Mit der dazu entwickelten Matlab-Software werden Hsp90 Proteinkomplexe untersucht und neue Einblicke in die Funktionsweise von Hsp90 gewonnen

Angaben zum Objekt

• Weitere Titel: Dissoziationskinetiken von Proteinkomplexen gemessen mit schnellen Mikrofluidik-Mixern auf einem konfokalen Mikroskop mit alternierend gepulster Anregung
• Standort: Deutsche Nationalbibliothek Frankfurt am Main
• Umfang: Online-Ressource
• Sprache: Englisch
• Anmerkungen: Universität Freiburg, Dissertation, 2020

Klassifikation und Themen

• Schlagwort: Dissociation ; Dilution ; Complexes ; Einzelmolekülspektroskopie ; Konfokale Mikroskopie ; Mikrofluidik ; Dissoziation ; Kinetik ; Dissoziationskonstante ; Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer ; Protein-Protein-Wechselwirkung

Beteiligte, Orts- und Zeitangaben

• Ereignis: Veröffentlichung
• (wo): Freiburg
• (wer): Universität
• (wann): 2020
• Urheber: Thurn, Johann
• Beteiligte Personen und Organisationen: Hugel, Thorsten ; Albert-Ludwigs-Universität Freiburg. Fakultät für Chemie und Pharmazie

Weitere Informationen

• DOI: 10.6094/UNIFR/165769
• URN: urn:nbn:de:bsz:25-freidok-1657693
• Rechteinformation: Der Zugriff auf das Objekt ist unbeschränkt möglich.
• Letzte Aktualisierung: 14.08.0551, 09:45 MEZ