Hochschulschrift

Untersuchungen zur Biosynthese der Rishirilide

Zusammenfassung: Rishirilid B ist ein Sekundärmetabolit, der durch die Polyketid Synthase des Typs II durch Streptomyces bottropensis (ehemals Streptomyces sp. Gö C4/4) gebildet wird. Die Grundstruktur besteht hierbei aus drei teilweise aromatischen Zyklen mit drei Seitenketten, was für Polyketide dieses Typs außergewöhnlich ist. Durch Sequenzuntersuchungen, Geninaktivierungen, Produktionsanalysen und in-vitro Assays konnten tiefere Einblicke in die Rishirilid B Biosynthese gewonnen werden. Die bereits erstellten Oxidoreduktase-Inaktivierungscosmide wurden durch einen Kontrollverdau auf ihre Richtigkeit überprüft, Produktionsanalysen der Inaktivierungsmutanten wurden auf ihre Reproduzierbarkeit untersucht und zusätzlich komplementiert. Des Weiteren wurden die Gene rslO3, rslO5, rslO7, rslO9, rslO7-O10 und rslH mittels Redirect® Technologie auf cos4 inaktiviert und deren Produktionsprofile im heterologen Wirt S. albus J1074 mittels HPLC-MS untersucht. Die Inaktivierung der im rsl-Gencluster vorhandenen zehn Oxidoreduktasen führte zum vollständigen Erliegen der Rishirilid B Produktion, mit Ausnahme der deletierten Flavinreduktase RslO2, der 3-Oxoacyl-(ACP) Reduktase RslO3 und der Luciferase-ähnlichen Monooxygenase RslO6. Für RslO2 war die Produktion reduziert und für RslO3 kaum noch nachweisbar. Für RslO6 wurde eine gesteigerte Produktion festgestellt. Die Rishirilid B Produktion war ebenfalls nach der Inaktivierung der im rsl-Gencluster codierten Amidohydrolase RslH erhöht. Die anderen Inaktivierungsmutanten zeigten viele verschiedene neue Peaks, die teilweise schon beschrieben wurden. Die Sekundärmetabolite JD2-d und JD14 aus S. albus cos4ΔrslO6 pUWL-H-rslR1R2R3 wurden aufgereinigt und Strukturvorschläge mittels NMR-Analyse ermittelt. Bei JD2-d handelt es sich um ein Shunt-Produkt, das vermutlich durch falsche Zyklisierung gebildet wird. JD14, das zunächst auf Grund der gleichen Masse für Rishirilid A gehalten wurde, entspricht der Rishirilid B Struktur mit einer zusätzlichen Hydroxylgruppe. Durch die durchgeführten Inaktivierungsexperimente und die Aminosäuresequenz-Analysen der verschiedenen Tailoring Enzyme konnte ein vollständiger Biosyntheseweg für Rishirilid B postuliert werden, in dem ein Intermediat gebildet wird, das zu Rishirilid A weiterreagieren könnte. Im postulierten Biosyntheseweg wird zunächst das durch die minimale PKS gebildete Nonaketid an C9 durch die C9-Ketoreduktase RslO10 reduziert, wodurch es zur richtigen Polyketid-Faltung kommt. Anschließenden werden drei Zyklisierungen durch die verschiedenen Rishirilid Zyklasen katalysiert. Nach der Hydrolyse vom Enzym und einer Decarboxylierung wird eine Carbonylfunktion durch die NADPH:Chinonoxidoreduktase RslO8 reduziert. Im weiteren Verlauf werden durch die Anthronmonooxygenase RslO4 eine Carbonylfunktion an C2 und durch die FAD-abhängige Monooxygenase RslO9 eine Hydroxyfunktion an C15 eingeführt. Anschließend findet die bereits beschriebene durch RslO1 und RslO2 katalysierte Baeyer-Villiger Oxidation statt, die nach der spontanen Lactonöffnung zur Umlagerung der Seitenketten führt. RslO7, das für eine NADPH:Chinonreduktase codiert, reduziert die Carbonylverbindung an C10, durch die eine Epoxidzwischenstufe entstehen könnte, die zum einen die Biosynthese von Rishirilid A erklären würde. Zum anderen könnte dieses Epoxid-Intermediat durch die NADH:Flavin Oxidoreduktase RslO5 reduziert werden, wodurch nach einer Dehydratisierungsreaktion das Produkt Rishirilid B resultieren würde. Auf Grund der erhöhten Rishirilid B Produktion nach der Inaktivierung der Gene rslO6 und rslH setzen die korrespondieren Proteine vermutlich Rishirilid B weiter um. Durch eine Strukturaufklärung der neu identifizierten Sekundärmetabolite könnte die postulierte Biosynthese verifiziert werden.Die Proteine RslO6 und RslO2 konnten erfolgreich überproduziert und aufgereinigt werden, wobei für RslO6 ebenfalls die Proteinstruktur aufgeklärt wurde. In-vitro Untersuchungen und Fütterungsexperimente konnten die postulierte Beteiligung von RslO6 in der Umwandlung von Rishirilid B zu Rishirilid A nicht belegen. Durchgeführte Aktivitätsuntersuchungen mit RslO2 zeigten, dass es sich um eine NADH-abhängige Flavinreduktase handelt, die FMN reduziert.Zuletzt wurde das Produktionsverhalten von S. bottropensis Wildtyp untersucht, der unter konventionellen Produktionsbedingungen nur Mensacarcin produziert, jedoch nach Einbringen der essentiellen Rishirilid Regulatoren sein Produktionsverhalten veränderte. RslR3 wirkte hierbei repressiv auf die Synthese von Mensacarcin, RslR1 und RslR2 jedoch nicht. Alle drei Regulatoren induzierten die Rishirilid B Produktion, wodurch bereits postulierte Regulationskaskaden bestätigt werden konnten
Zusammenfassung: Rishirilide B is a secondary metabolite produced by the polyketide synthase type II of Streptomyces bottropensis (formerly Streptomyces sp. Goe C4/4). The basic structure consists of three partially aromatic cycles with three side chains which is exceptional for polyketides of this type.Sequence analyses, gene inactivations, production analyses and in-vitro assays gained deeper insights into Rishirilide B biosynthesis. Already constructed oxidoreductase inactivation cosmids were examined by control digestion for their correctness, production analyses of the different inactivation mutants which were repeated to check for their reproducibility and complementation. In addition, the genes rslO3, rslO5, rslO7, rslO9, rslO7-O10 und rslH were inactivated on cos4 by Redirect® technology. Their production profiles in the heterologous strain S. albus cos4 J1074 were then analyzed by HPLC-MS. The deletion of the ten oxidoreductases of the rsl gene cluster led to complete disruption of Rishirilide B production. Exceptions were established for inactivated flavinreductase RslO2, the 3-oxoacyl-(acyl-carrier-protein) reductase RslO3 and the luciferase-like monooxygenase RslO6. RslO2 production was reduced and RslO3 was almost undetectable. Higher production was shown for RslO6 and Rishirilide B production also increased after inactivation of the gene coding for the amidohydrolase RslH. The other deletion mutants showed several other new peaks that have been partially described previously. The secondary metabolites JD2-d and JD14 from S. albus cos4ΔrslO6 pUWL-H-rslR1R2R3 were purified and suggestions of their structure were determined by NMR analyses. JD2-d is a shunt product that is probably formed by incorrect cyclisation. JD14 corresponds to Rishirilide B with an additional hydroxyl group and not Rishirilide A, as previously thought, due to its identical mass. A complete Rishirilide B biosynthesis pathway could be postulated because of the inactivation experiments performed and the analyses of amino acid sequences of the different tailoring enzymes. In this pathway an intermediate is formed which could react to Rishirilide A in a further step. In the pathway postulated, a nonaketide is initially built by the minimal PKS. In the next step, the ketone on carbon C9 is reduced by the C9-ketoreductase RslO10 resulting in the correct folding of the polyketide chain. Thereafter three cyclisations are catalyzed by the different Rishirilide cyclases. After hydrolysis of the enzyme and a decarboxylation reaction, a carbonyl function is reduced by the NADPH:chinone oxidoreductase RslO8. The next steps consist of the introduction of a carbonyl function to C2 by the anthrone monooxygenase RslO4 and a hydroxyl group by the FAD-dependent monooxygenase RslO9 to C15. Subsequently the Baeyer-Villiger oxidation, already described, then takes place, which is catalyzed by RslO1 and RslO2, followed by the spontaneous lactone opening mechanism and the rearrangement of the side chains. RslO7, encoding for a NADPH:chinone reductase, reduces the carbonyl group on carbon C10 possibly resulting in an epoxide intermediate which could explain the formation of Rishirilide A. Moreover, this epoxide intermediate could be reduced by the NADH:flavin oxidoreductase RslO5 resulting in the final product Rishirilide B after a dehydration reaction. Because of increased Rishirilide B production after deletion of the genes rslO6 and rslH, it is probable that the corresponding enzymes are involved in the further conversion of Rishirilide B. This proposed biosynthetic pathway could be verified by clarifying the structures of the newly identified secondary metabolites. The proteins RslO6 and RslO2 could be overproduced and purified successfully. The protein structure of RslO6 also could be solved. In-vitro analyses and feeding experiments could not prove the postulated involvement in the conversion of Rishirilide B to Rishirilide A. Activity tests carried out for RslO2 showed that this enzyme is an NADH-dependent flavinreductase responsible for reducing FMN. Finally, the production properties of wild type S. bottropensis were investigated. Conventional production conditions show only Mensacarcin being produced. After introducing the essential Rishirilide regulators the production profile of S. bottropensis changed - RslR3 has a repressive function on Mensacarcin biosynthesis. This did not occur with RslR1 or RslR2. All three regulators induced Rishirilide B production confirming regulation cascades already postulated

Standort
Deutsche Nationalbibliothek Frankfurt am Main
Umfang
Online-Ressource
Sprache
Deutsch
Anmerkungen
Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, Dissertation, 2016

Klassifikation
Biowissenschaften, Biologie
Schlagwort
Biosynthese
Präparat
Streptomycetaceae
Escherichia coli
Plasmid
Sekundärmetabolit
Oxygenasen
Cosmid
Oxidoreductasen
Agargel-Elektrophorese
Stamm
Streptomyces
Polyketide
Naturstoff
Biosynthese
Gencluster
Oxidoreductasen

Ereignis
Veröffentlichung
(wo)
Freiburg
(wer)
Universität
(wann)
2016
Urheber
Beteiligte Personen und Organisationen

DOI
10.6094/UNIFR/10604
URN
urn:nbn:de:bsz:25-freidok-106047
Rechteinformation
Der Zugriff auf das Objekt ist unbeschränkt möglich.
Letzte Aktualisierung
25.03.2025, 13:56 MEZ

Datenpartner

Dieses Objekt wird bereitgestellt von:
Deutsche Nationalbibliothek. Bei Fragen zum Objekt wenden Sie sich bitte an den Datenpartner.

Objekttyp

  • Hochschulschrift

Beteiligte

Entstanden

  • 2016

Ähnliche Objekte (12)