Biosensor für die SERCA-Phospholamban-Interaktion

Abstract: Bei einer Herzinsuffizienz mit reduzierter Ejektionsfraktion (HFrEF) werden geringere Ca2+-Mengen durch die sarkoplasmatische Retikulum ATPase (SERCA2a) in das sarkoplasmatische Retikulum der Kardiomyozyten aufgenommen. Ursächlich sind unter anderem reduzierte Expressionslevel der SERCA2a und somit eine relative Kon-zentrationssteigerung des SERCA2a-inhibierenden dephosphorylierten Phospholam-ban (PLB). Vor diesem Hintergrund bietet die Modifizierung der SERCA2a-PLB-Interaktion eine Möglichkeit für die Verbesserung der HFrEF-Therapie. Ein potenzieller Ansatz ist die Induktion einer Phosphorylierung von PLB an Serin 16 (Ser16). Zur differenzierten Analyse der Interaktion zwischen SERCA2a und PLB und zur Visualisierung der Phosphorylierung von PLB wurde ein pGFP-basierter Biosensor (SGP-Fusionsprotein) entwickelt. Das SGP-Protein besteht aus der SERCA2a, einem permutierten GFP (pGFP) und PLB. Die drei Bestandteile sind durch Linker ver-bunden. Die Rationale hinter der Konstruktion des SGP-Proteins ist, dass sich die phosphorylierungsbedingten Konformationsveränderungen (z. B. an Ser16) des PLB über die Linker auf das pGFP übertragen und zu einer Veränderung der Fluoreszenz-intensität führen. Als Kontroll-Protein diente ein SG-Fusionsprotein ohne PLB-Domäne und damit ohne die Phosphorylierungsstelle Ser16. Die Western Blot-Experimente ergaben, dass mit SGP-DNA transfizierte HEK 293 und H9c2 Zellen das 145 kDa große, rekombinante Fusionsprotein exprimieren. Eine Aktivierung der PKA mit Forskolin führte zur Phosphorylierung der PLB-Domäne an Ser16. Im Fluoreszenzmikroskop wurde eine signifikante Helligkeitszunahme nach Zugabe von Forskolin ermittelt. Anhand dieser Ergebnisse ist davon auszugehen, dass die Phosphorylierung von PLB an Ser16 durch eine Konformationsveränderung über den Linker auf das pGFP übertragen wird und zu einer Fluoreszenzintensitäts-steigerung führt. Der Nachweis einer Aktivierung der CaMKIIδ durch Ionomycin und einer daraus resultierenden Phosphorylierung von Thr17 konnte nicht abschließend erbracht werden. Ein 45Ca-Aufnahme-Assay lieferte Hinweise darauf, dass sowohl die SERCA2a als auch das PLB ihre physiologischen Aufgaben als Ca2+-Pumpe bzw. Regulatorprotein im SGP-Protein erfüllen können. Damit konnte in dieser Arbeit ein Biosensor validiert werden, der eine schnelle Se-lektion von potenziell PLB-phosphorylierenden Substanzen ermöglichen soll. Solche Substanzen könnten indirekt die SERCA2a-Aktivität steigern und somit HFrEF-bedingte Umbauvorgänge reduzieren

Object Details

• Location: Deutsche Nationalbibliothek Frankfurt am Main
• Extent: Online-Ressource
• Language: Deutsch
• Notes: Universität Freiburg, Dissertation, 2022

Classification and Topics

• Keyword: Herzinsuffizienz ; Sarkoplasmatisches Retikulum ; Renin-Angiotensin-System ; Phospholamban ; Biosensor ; Calcium ; Herzinsuffizienz ; Phospholamban ; Sarkoplasmatisches Retikulum ; New York, NY

Contributors, Places and Time

• Event: Veröffentlichung
• (where): Freiburg
• (who): Universität
• (when): 2022
• Creator: Arnold, Maren Eleni
• Contributor: Meyer, Markus F. ; Hein, Lutz ; Albert-Ludwigs-Universität Freiburg. Abteilung Pharmakologie II ; Albert-Ludwigs-Universität Freiburg. Medizinische Fakultät

Further information

• DOI: 10.6094/UNIFR/223475
• URN: urn:nbn:de:bsz:25-freidok-2234753
• Rights: Kein Open Access; Der Zugriff auf das Objekt ist unbeschränkt möglich.
• Last update: 15.08.2025, 7:40 AM CEST