Einfluss der Substratsteifigkeit auf retinale Pigmentepithelzellen

Abstract: Im Laufe des Lebens können sich die mechanischen Eigenschaften der Umgebung des retinalen Pigmentepithels verändern, beispielsweise durch physiologische Alterungsprozesse oder durch pathologische Ablagerungen, wie sie bei der altersbedingten Makuladegeneration (AMD) vorkommen. Die biomechanischen Eigenschaften der Umgebung beeinflussen die Funktion und Differenzierung vieler Zellen. Ihnen wird auch eine Rolle bei der Entstehung verschiedener Erkrankungen zugeschrieben. In dieser Arbeit wurde daher der Einfluss der Substratsteifigkeit auf retinale Pigmentepithelzellen (RPE) untersucht.
Hierfür wurde eine RPE-Zelllinie (ARPE-19) auf Polyacrylamidgelen unterschiedlicher Steifigkeit (Elastizitätsmodul von ca. 30 und 80 kPa) und auf Zellkulturplastik kultiviert. In Phasenkontrastaufnahmen und immunhistochemischen Färbungen wurden Morphologie, Zelldichte und Zytoskelett der Zellen untersucht. Das Transkriptom der Zellen wurde sequenziert und einzelne Gene mittels digitaler PCR analysiert. Das von den auf verschiedenen Untergründen kultivierten Zellen konditionierte Medium wurde auf angiogene Faktoren und auf seine Wirkung auf Gefäßendothel untersucht.
Die Steifigkeit des Untergrundes beeinflusst Zytoskelett, Morphologie, Transkriptom und angiogene Eigenschaften von ARPE-19-Zellen. Unterschiede in der Substratsteifigkeit führen zu unterschiedlicher Zelldichte und Homogenität von Zellform und -größe. So weisen die Zellen auf weichen Gelen eine geringere Zelldichte und eine höhere Variabilität der Zellform auf, ähnlich dem Bild in vivo bei Patient*innen mit AMD. Unter den Genen, die auf den harten und weichen Untergründen differenziell exprimiert wurden, sind insbesondere Gene, die an Prozessen wie Zelladhäsion, Angiogenese oder der Antwort auf fehlgefaltete Proteine und oxidativen Stress beteiligt sind. Die substratvermittelten Zelldichteunterschiede können dabei zum Teil den Einfluss der Substratsteifigkeit auf das Transkriptom der ARPE-19 Zellen erklären. ARPE-19-Zellen sezernieren eine Reihe gefäßwirksamer Faktoren. Ein Teil der Faktoren wird dabei abhängig von der Substratsteifigkeit exprimiert. Konditioniertes Medium von ARPE-19-Zellen auf weichem Untergrund stimuliert die Proliferation und Migration von Gefäßendothel.
Zum einen zeigen die Experimente, dass die Kulturbedingungen einen großen Einfluss auf retinale Pigmentepithelzellen haben. Die starke Auswirkung der Konfluenz auf die Zellen legt nahe, dass der Konfluenzstatus bei Experimenten mit epithelialen Zellkulturen generell stärker berücksichtigt werden sollte, insbesondere bei der Anwendung weicher Zellkultursubstrate. Zum anderen können die vorliegenden Experimente als ein einfaches Modell für einige Aspekte der altersbedingten Makuladegeneration dienen, wenn man davon ausgeht, dass diffuse „weiche“ Drusen bei der AMD aufgrund ihrer Zusammensetzung weicher und weniger adhäsionsfördernd sind als die umgebende Bruch-Membran. So können sie zum Verständnis der Pathogenese dieser Erkrankung beitragen
Abstract: Physiological and pathological processes such as ageing or the aggregation of basal deposits in age-related macular degeneration (AMD) can alter the mechanical properties of Bruch’s membrane. Little is known about how these changes affect the overlying retinal pigment epithelial (RPE) cells.
To characterize the influence of substrate stiffness on RPE cells, an RPE cell line (ARPE-19) was cultured on hydrogels of differing physiological Young’s moduli (30 and 80 kPa) and tissue culture plastic. Phase contrast microscopy and immunofluorescence stains were used to characterize the morphology, cell density and cytoskeleton of the ARPE-19 cells. The transcriptome was analyzed using sequencing and digital PCR. ARPE-19 cell conditioned medium was screened for angiogenic factors and was used to stimulate endothelial cells in angiogenesis assays.
Substrate stiffness influences the cytoskeleton, morphology, transcriptome and angiogenic potential of ARPE-19 cells. Different substrate stiffnesses lead to differences in cell density and homogeneity. Cells on softer hydrogels grow more sparsely and display a greater variability of cell size and shape, similar to RPE in AMD patients. Several genes were differentially expressed on soft and stiff substrates, among them genes associated with cell adhesion, angiogenesis, oxidative stress and unfolded protein response. The effect of the substrate stiffness on RPE cells can partially be explained by the substrate-mediated differences in cell density. ARPE-19 cells release vasoactive factors, some of them are expressed substrate-dependently. Conditioned supernatant from ARPE-19 cells on soft gels stimulates proliferation and migration of endothelial cells.
These experiments show that substrate stiffness, but also the degree of confluency have a great influence on retinal pigment epithelial cells. The degree of confluency should be taken into account in experiments with epithelial cells, especially when cells are cultured on soft substrates.
Furthermore, these experiments can serve as a simple model for some aspects of age-related macular degeneration, provided that “soft” drusen as seen in AMD are softer and do not support adhesion as the healthy Bruch’s membrane does, due to their different composition. In this way, this work can contribute to the further understanding of the pathophysiology of the disease

Object Details

• Location: Deutsche Nationalbibliothek Frankfurt am Main
• Extent: Online-Ressource
• Language: Deutsch
• Notes: Universität Freiburg, Dissertation, 2022

Classification and Topics

• Keyword: Senile Makuladegeneration ; Pathogenese ; Tiermodell ; Photorezeptor ; Biomechanik

Contributors, Places and Time

• Event: Veröffentlichung
• (where): Freiburg
• (who): Universität
• (when): 2022
• Creator: Gimpel, Clara
• Contributor: Schlunck, Günther ; Schlunck, Günther ; Rolauffs, Bernd ; Klinik für Augenheilkunde. Freiburg im Breisgau ; Albert-Ludwigs-Universität Freiburg. Medizinische Fakultät

Further information

• DOI: 10.6094/UNIFR/227872
• URN: urn:nbn:de:bsz:25-freidok-2278722
• Rights: Open Access; Der Zugriff auf das Objekt ist unbeschränkt möglich.
• Last update: 25.03.2025, 1:44 PM CET