Etablierung eines dreidimensionalen Kokulturmodells und Testung epigenetisch-aktiver Hemmstoffe beim Multiplen Myelom

Abstract: Das zunehmende Verständnis über die pathophysiologische Rolle des Knochenmarks bei der Erkrankung des Multiplen Myeloms führte in den vergangenen Jahrzehnten zur Entwicklung zahlreicher Therapieoptionen. Obwohl neue niedermolekulare Substanzen und monoklonale Antikörper das mediane Gesamtüberleben von Myelom-Patienten deutlich verbessert haben, ist diese Plasmazellneoplasie bis heute nur selten kurativ zu behandeln. Die Vielzahl der verfügbaren Behandlungsoptionen und die Bedeutung des Tumormilieus bei der Entstehung von Therapieresistenzen stellen besondere Herausforderungen bei der Etablierung patientenindividueller Kombinationstherapie mit langanhaltender Wirksamkeit dar.
Aus diesem Grund wurden im Rahmen dieser Arbeit zwei dreidimensionale ex-vivo-Kokulturmodelle untersucht und hinsichtlich ihrer Eignung zur Substanztestung für semi-adhärente Myelom-Zellen und primäre Knochenmarkproben bewertet. In einem zweiten Schritt wurden die Effekte überwiegend Subklassen-spezifischer epigenetisch-aktiver Hemmstoffe auf die Viabilität von Myelom-Zellen analysiert. Darauf aufbauend wurde der Einfluss der zytotoxischen epigenetisch-aktiven Inhibitoren auf das Expressionslevel therapeutisch relevanter Antigene (CD138, CD38, SLAMF7 und CXCR4) durchflusszytometrisch evaluiert, um rationale Kombinationspartner für eine Antikörpertherapie zu identifizieren.
Myelom-Zelllinien bzw. primäre Knochenmarkproben wurden in das Conical Agarose Microwell Array (CAMA) oder mittels Liquide Overlay Technique (LOT) ausgesät. Das 3D-Clusterwachstum bzw. das Therapieansprechen in 3D-Kultur wurden mittels Mikroskopie und einer etablierten Durchlichtscanner-Analyse quantifiziert. Das anschließende Screening epigenetisch-aktiver Substanzen schloss drei Inhibitoren epigenetischer reader Proteine (Bromodomain, Kme-reader, PRMT/reader), acht Hemmstoffe epigenetischer writer Proteine (G9a, DOT1L, EHZ2, SETD7, WDR5, HATs) und 24 Wirkstoffe zur Hemmung epigenetischer eraser Proteine (panKDM, LSD1, KDM5, HDACs) ein.
Im Gegensatz zum LOT-Modell ermöglichte das CAMA-Modell mit seinen definierten konischen Mikrokavitäten die Ausbildung 3D-Plasmazellcluster und vermittelte eine Resistenzentwicklung der Myelom-Zellen gegenüber Behandlung mit Proteasom-Inhibitoren. In diesem Zusammenhang wurde zusätzlich eine gleichmäßige Wirkstoffpermeation in die 3D-Zellagglomerate bzw. eine Akkumulation niedermolekularer Substanzen in den Agarosematrices mittels Fluoreszenzfarbstoffen und konfokaler Mikroskopie nachgewiesen. Darüber hinaus zeigten Myelom-Zellen innerhalb der Mikrokavitäten ein verzögertes sigmoidales Clusterwachstum. Mit der etablierten Durchlichtscanner-Analyse konnte ein 3D-Clusterwachstum primärer Myelom-Zellen über mindestens 2 Wochen ex vivo nachgewiesen werden sowie durch immunhistologische Färbungen bzw. mikroskopische Aufnahmen verifiziert werden.
Im Rahmen des epigenetischen Wirkstoffscreenings konnte für 11 der 35 getesteten Inhibitoren ein zytotoxischer Effekt in 2 Myelom-Zelllinien nachgewiesen werden. Darunter waren EZH2, panKDM und KDM5-selektive Hemmstoffe sowie pan-Histondesacetylase-Inhibitoren (panHDACis), Klasse I-selektive HDACis und Isoform-selektive HDACis für HDAC3, HDAC6, HDAC8 und HDAC10. Für den selektiven HDAC6i JS28 wurde die Selektivität an der zellulären Zielstruktur in Myelom-Zellen verifiziert und ein funktioneller pharmakologischer Synergismus mit dem Proteasom-Inhibitor Bortezomib nachgewiesen. Die weiterführende Evaluation der Antigenexpressionslevel unter Behandlung mit zytotoxischen epigenetisch-aktiven Hemmstoffen ergab u.a. eine dosisabhängige Erhöhung der CD38-Level durch die Klasse I-selektiven Inhibitoren Entinostat und Mocetinostat auf Myelom-Zellen. Damit können beide bereits klinisch erprobten Klasse I-selektiven HDACis als mögliche rationale Kombinationspartner für eine verbesserte anti-CD38-Antikörpertherapie im Rahmen klinischer Studien weiter untersucht werden.
Das etablierte CAMA-Modell bietet für die Kultur von Myelom-Zellen wesentliche Vorteile gegenüber der LOT und anderen Modellen. Es ermöglicht semi-adhärenten Plasmazellen die Formation solider Clusterstrukturen und fördert ein verzögertes, sigmoidales Wachstum von Zellagglomeraten. Darüber hinaus kann das Volumen von ca. 950 Zellclustern pro Agarosematrix zeitgleich über die nicht-destruktive Durchlichtscanner-Analyse verfolgt werden. Außerdem bietet das CAMA-Modell die Möglichkeit, primäre Knochenmarkproben ex vivo über mindestens 2 Wochen zu kultivieren. Aus der Substanztestung epigenetisch-aktiver Hemmstoffe konnten die beiden Klasse I-selektiven HDACis Entinostat und Mocetinostat als potentielle klinische Kombinationpartner für eine verbesserte anti-CD38-Antikörpertherapie abgeleitet werden
Abstract: Over the past decades, the understanding of the pathophysiological alterations inside the bone marrow (BM) in multiple myeloma (MM) led to numerous new treatment strategies. Albeit the development of small molecules and monoclonal antibodies has substantially improved the median survival of MM patients, this plasma cell (PC) malignancy remains most often incurable. The variety of treatment options and the crucial role of the tumor microenvironment in drug resistance constitute a challenge to establish best possible drug combinations for improved long-term efficacy.
For this purpose ex vivo screening platforms for three-dimensional (3D) co-culture of semi-adherent MM cells and primary BM samples were evaluated. Furthermore a screening of primarily subclass selective epigenetic modifying agents for their anti-MM activity was performed. Subsequently the influence of cytotoxic epigenetic drugs on therapeutic antigen levels (CD138, CD38, SLAMF7, CXCR4) was assessed to define most suitable antibody epigenetic combination therapies for future clinical studies.
MM cell lines (MMCLs) and primary BM samples from MM patients were seeded into the Conical Agarose Microwell Array (CAMA) or Liquid Overlay Technique (LOT). The cluster growth or treatment responses were analyzed via microscopic imaging and non-destructive transmitted light scanner analysis. The epigenetic screening approach included three inhibitors for epigenetic reader proteins (bromodomain, Kme-reader, PRMT/reader), eight compounds impeding writer enzymes (G9a, DOT1L, EHZ2, SETD7, WDR5, HATs) and 24 drugs inhibiting epigenetic erasers (panKDM, LSD1, KDM5, HDACs).
In contrast to the LOT, the well-defined, steep microwells of the CAMA enabled semi-adherent PCs to form 3D-aggregates and mediated drug resistance to proteasome-inhibitors. In this context qualitative confocal analysis of mCherry-transduced RPMI 8226-cells and fluorescent dye staining demonstrated even drug distribution within the 3D-clusters or agarose matrices. Moreover, MM cells seeded into the microcavities showed prolonged sigmoidal cluster growth. Using our established transmitted light scanner technique, stable proliferation of primary MM cells could be monitored for at least two weeks in a non-destructive manner and correlated to immunohistological staining and microscopic imaging.
The evaluation of the epigenetic drug library identified 11 out of 35 compounds with potent anti-MM activity in two MMCLs, including EZH2, panKDM and KDM5-selective inhibitors, but also pan-histondeacetylase-inhibitors (HDACis), class-I-selective HDACis and subclass selective HDACis for HDAC3, HDAC6, HDAC8 and HDAC10. For the selective HDAC6i JS28, the selectivity on target via western blot and functional synergism with bortezomib could be demonstrated in two MMCLs. The subsequent antigen analysis was performed using the broad selection of cytotoxic HDACis. A dose-dependent increase of CD38, up to 140 % in the presence of class I selective HDACis entinostat and mocetinostat was detected. This indicating that class I-selective HDACis may be rational combination partners for improved long-term anti-CD38 antibody therapy.
Our CAMA provides various advantages in MM, namely 1. solid cluster formation of semi-adherent PCs including more sigmoidal proliferation and drug resistance, 2. simultaneous, non-destructive observation of approx. 950 spheroids per matrix over time and 3. cultivation of proliferating and viable primary BM samples for at least 2 weeks. By using our investigated epigentic toolbox for subclass selective functional analysis, we found class I HDACis to upregulate CD38 expresion levels, which indicates that specific HDACi are promising and could serve as rationally-tested combination partner for anti-CD38 antibody therapy in subsequent clinical trials

Object Details

• Location: Deutsche Nationalbibliothek Frankfurt am Main
• Extent: Online-Ressource
• Language: Deutsch
• Notes: Universität Freiburg, Dissertation, 2019

Classification and Topics

• Keyword: Müller, Johann Heinrich Jacob ; Plasmozytom ; Epigenetik ; Inhibitor ; Epigenetik ; In-vitro-Kultur ; Dreidimensionales Modell ; Plasmozytom

Contributors, Places and Time

• Event: Veröffentlichung
• (where): Freiburg
• (who): Universität
• (when): 2019
• Creator: Müller, Stefan Jürgen
• Contributor: Jung, Manfred ; Engelhardt, Monika ; Albert-Ludwigs-Universität Freiburg. Fakultät für Chemie und Pharmazie

Further information

• DOI: 10.6094/UNIFR/151255
• URN: urn:nbn:de:bsz:25-freidok-1512556
• Rights: Der Zugriff auf das Objekt ist unbeschränkt möglich.
• Last update: 25.03.2025, 1:42 PM CET