Handling of microparticles for assay automation in centrifugal microfluidics

Abstract: Diagnostics and analytics today are not limited to the well-established centralized laboratories but should also be able to be performed in poorly resourced health care facilities with limited clinical laboratory infrastructures where most people nowadays, particularly in the developing world, could access. Miniaturized, highly automated, rapid and precise diagnostic and analytical tests are highly demanded. Recent advances in centrifugal microfluidics enable to integrate complex laboratory workflows into a compact disc like a DVD, which is compatible to scalable, cost-effective fabrication techniques and can be processed in a compact and portable processing device. For automation of affinity-based separation assays in centrifugal microfluidics, microparticles are widely used as solid support to bind the target analytes specifically mainly due to the high surface-to-volume ratio. Efficient handling of microparticles is the key factor for achieving high performance in such assays. This thesis addresses three advanced methods for handling of microparticles in centrifugal microfluidics. All these methods allow re-suspension of microparticles and separation of microparticles from the liquid carrier medium. In addition, some methods also feature transport of microparticles and liquid routing, which are relevant for some specific applications.
Within this work, three new methods are developed in centrifugal microfluidics for handling of microparticles. The particle handling is triggered by centrifugation only without the need for other means such as magnets, filters and coatings. The first method enables continuous particle re-suspension and separation of microparticles from the liquid. Limited by the capillary valve, the developed method cannot handle highly wetting liquid and is not capable of performing multiple sequential operations if liquids containing biochemical substances that tend to adsorb to channel walls are operated. The second method enables particle re-suspension, separation of particles from the liquid carrier medium, liquid routing between the path of the waste fluid and the path of the reaction product, handling of wetting liquid, several sequential steps for liquid or particle handling and transport of microparticles. However, the time for particle resuspension is limited by the microfluidic timer. When performing liquid routing through the second fluidic path, leakage flow occurs via the first fluid path. Thus, the third method is developed to overcome these drawbacks. The third method enables particle re-suspension without time limitation, separation of particles from the liquid carrier medium, liquid routing between the path of the waste fluid and the path of the reaction product with 100 % efficiency, handling of wetting liquid and several sequential steps for liquid or particle handling. All the methods are compatible with monolithic integration and can be integrated with other fluidic elements to perform particle-based assays. In addition, these methods are suitable for mass production technologies e.g. thermoforming or injection molding. The microfluidic cartridge can be produced to be low-cost and disposable. These methods meet the requirements of a wide range of particle-based assays such as immunoassay and nucleic acid assays. They potentially expand the possibility to perform a wide range of particle-based assays in centrifugal microfluidics for point of care applications.
The first method described in chapter 4.1 enables re-suspension of microparticles and separation of microparticles from the liquid carrier medium. It employs a capillary valve to hold particles and liquid in a mixing chamber and shake mode is performed to re-suspend the particles. Separation of particles from the liquid is achieved by first sedimentation and subsequently removal of supernatant. Almost all sedimented particles can be resuspended. No unwanted particle transport was observed during separation of microparticles from the liquid. Based on this method, automated sample to answer detection of botulinum neurotoxins is demonstrated in chapter 6.2. Functionalized microparticles are pre-stored on the LabDisk as freeze-dried pellet. The integrated LabDisk for sample to answer detection of BoNT with pre-stored reagent can be stored at room temperature and requires only sample loading. All the other processes are automated on a compact and portable processing device. The promoted method could detect BoNT in two different buffers down to 2 pM and 13 pM respectively within 2.1 h without the need of highly trained personnel.
Chapter 4.2 describes the second method that features multiple sequential operation of re-suspension of microparticles, separation of microparticles from liquid, transport of microparticles and liquid routing. The method integrates a microfluidic timer with two siphons. Particle resuspension is achieved in the microfluidic timer by shake mode and the timer precisely defines the particle resuspension time. More than 93 % sedimented particles can be resuspended. Separation of particles from the liquid is achieved by sedimentation of the particles and subsequently removal of the supernatant. The particle loss during separation of particles from the liquid is below 7 % and the residual liquid remaining within the particles is below 0.5 %. Timewise, the particles are resuspended 59 % of the time in one mixing cycle. The two siphons enable routing of liquid or particle suspension through the selected route simply by controlling the acceleration rate. The sedimented particles can be resuspended and transported together with the liquid carrier medium via a defined fluidic path with a particle loss below 7 %. By triggering merely the lower siphon, liquid flows to a waste chamber. To rout liquid or microparticles via another fluidic path, both the lower siphon and the upper siphon can be triggered simultaneously. Due to the high fluidic resistance in the lower siphon, up to 98 % of liquid can be transported through the upper siphon.
The last method proposed in chapter 4.3 can perform separation of microparticles from the liquid carrier medium, re-suspension of microparticles and highly efficient liquid routing. Like the second method, this method also integrates a microfluidic timer with two siphons. However, the particle handling is performed in an inlet chamber instead of the microfluidic timer. The timer here is only used for siphon priming. Thus, the particle resuspension time is not limited by the microfluidic timer anymore. Theoretically, all particles can be resuspended by shake mode at low rotational frequencies. The particle loss during separation of particles from the liquid is below 4 % and the residual liquid remaining within the particles is below 3.5 %. Timewise, the particles can be resuspended without any time limitation. The new featured double siphon configuration enables 100 % liquid routing through two fluidic paths to two different chambers. Multiple sequential operations can be achieved as well. Based on this method, a fully automated centrifugal microfluidic method for particle based protein immunoassays is demonstrated in chapter 6.1. Stick-pack technology is employed for pre-storage and release of liquid reagents. Functionalized microparticles are pre-stored as a dried pellet. The automated immunoassay concept is composed of on demand ligand binding, two washing steps, the substrate reaction, timed separation of the reaction products, and termination of the substrate reaction. The automated immunoassay concept was demonstrated by means of detecting C-reactive protein (CRP) in the range of 1–81 ng ml−1 and interleukin 6 (IL-6) in the range of 64–13500 pg ml−1. The limit of detection and quantification were 1.0 ng ml−1 and 2.1 ng ml−1 for CRP and 64 pg ml−1 and 205 pg ml−1 for IL-6, respectively
Abstract: Die Diagnostik und Analytik beschränkt sich heute nicht nur auf die etablierten zentralisierten Labors, sondern sollte auch in schlecht ausgestatteten Gesundheitseinrichtungen mit begrenzter klinischer Laborinfrastruktur durchgeführt werden können, auf die die meisten Menschen heutzutage, insbesondere in den Entwicklungsländern, zugreifen können. Miniaturisierte, hochautomatisierte, schnelle und präzise Diagnose- und Analysetests sind sehr gefragt. Die jüngsten Fortschritte in der zentrifugalen Mikrofluidik ermöglichen es, komplexe Laborabläufe in eine DVD-ähnliche kompakte Disk zu integrieren, die kompatibel zu skalierbaren, kostengünstigen Fertigungstechniken ist und in einem kompakten und tragbaren Verarbeitungsgerät verarbeitet werden kann. Zur Automatisierung von affinitätsbasierten Separations-Assays in der zentrifugalen Mikrofluidik werden Mikropartikel häufig als fester Träger verwendet, um die Zielanalyten zu binden, vor allem aufgrund des hohen Oberflächen-Volumen-Verhältnisses. Der effiziente Umgang mit Mikropartikeln ist der Schlüsselfaktor für eine hohe Leistung in solchen Assays. Diese Arbeit beschäftigt sich mit drei fortgeschrittenen Methoden für den Umgang mit Mikropartikeln in der zentrifugalen Mikrofluidik. Alle diese Methoden ermöglichen die Re-Suspension von Mikropartikeln und die Trennung von Mikropartikeln vom flüssigen Trägermedium. Darüber hinaus bieten einige Methoden auch den Transport von Mikropartikeln und die Flüssigkeitsführung, die für einige spezifische Anwendungen relevant sind.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden drei neue Methoden in der zentrifugalen Mikrofluidik für den Umgang mit Mikropartikeln entwickelt. Das Partikelhandling wird nur durch Zentrifugation ausgelöst, ohne dass andere Mittel wie Magnete, Filter und Beschichtungen erforderlich sind. Das erste Verfahren ermöglicht die kontinuierliche Partikelrücksuspension und die Trennung von Mikropartikeln aus der Flüssigkeit. Das entwickelte Verfahren, das durch das Kapillarventil begrenzt ist, kann keine stark benetzende Flüssigkeit aufnehmen und ist nicht in der Lage, mehrere aufeinanderfolgende Operationen durchzuführen, wenn Flüssigkeiten mit biochemischen Substanzen, die dazu neigen, an Kanalwänden zu adsorbieren, betrieben werden. Das zweite Verfahren ermöglicht die Partikelrücksuspension, die Trennung von Partikeln vom flüssigen Trägermedium, die Flüssigkeitsführung zwischen dem Weg der Abfallflüssigkeit und dem Weg des Reaktionsproduktes, die Handhabung der benetzenden Flüssigkeit, mehrere aufeinanderfolgende Schritte für die Handhabung von Flüssigkeiten oder Partikeln und den Transport von Mikropartikeln. Die Zeit für die Partikelrücksuspension wird jedoch durch einen mikrofluidischen Timer begrenzt. Bei der Durchführung der Flüssigkeitsführung durch den zweiten Fluidweg erfolgt die Leckströmung über den ersten Fluidweg. So wird die dritte Methode entwickelt, um diese Nachteile zu überwinden. Das dritte Verfahren ermöglicht die zeitunabhängige Partikelrücksuspension, die Trennung von Partikeln aus dem flüssigen Trägermedium, die Flüssigkeitsführung zwischen dem Weg der Abfallflüssigkeit und dem Weg des Reaktionsproduktes mit 100 % Effizienz, die Handhabung der benetzenden Flüssigkeit und mehrere aufeinanderfolgende Schritte für die Handhabung von Flüssigkeiten oder Partikeln. Alle Methoden sind mit der monolithischen Integration kompatibel und können mit anderen fluidischen Elementen integriert werden, um partikelbasierte Assays durchzuführen. Darüber hinaus eignen sich diese Verfahren für Massenproduktionstechnologien wie z.B. Mikro-Thermoformen oder Spritzgießen. Die Mikrofluidikkartusche kann kostengünstig und zum Einmalgebrauch hergestellt werden. Diese Methoden erfüllen die Anforderungen einer Vielzahl von partikelbasierten Assays wie Immunoassay und Nukleinsäureassays. Sie erweitern potenziell die Möglichkeit, eine breite Palette von partikelbasierten Assays in der zentrifugalen Mikrofluidik für Point of Care-Anwendungen durchzuführen.
Das erste in Kapitel 4.1 beschriebene Verfahren ermöglicht die Re-Suspension von Mikropartikeln und die Trennung von Mikropartikeln aus dem flüssigen Trägermedium. Es verwendet ein Kapillarventil, um Partikel und Flüssigkeit in einer Mischkammer zu halten, und der Schüttelmodus wird durchgeführt, um die Partikel wieder zu suspendieren. Die Abtrennung der Partikel aus der Flüssigkeit erfolgt durch erste Sedimentation und anschließende Entfernung des Überstandes. Fast alle sedimentierten Partikel konnten resuspendiert werden. Bei der Trennung von Mikropartikeln aus der Flüssigkeit wurde kein unerwünschter Partikeltransport beobachtet. Basierend auf dieser Methode wird in Kapitel 6.2 eine automatisierte Probe zum Nachweis von Botulinum-Neurotoxinen (BoNT) gezeigt. Funktionalisierte Mikropartikel werden auf der LabDisk als gefriergetrocknetes Pellet vorgelagert. Die integrierte LabDisk für Proben zur Erkennung von BoNT mit vorgelagertem Reagenz kann bei Raumtemperatur gelagert werden und erfordert nur eine Probenladung. Alle anderen Prozesse werden auf einer kompakten und tragbaren Verarbeitungsvorrichtung automatisiert. Die geförderte Methode könnte BoNT in zwei verschiedenen Puffern bis hinunter zu 2 pM bzw. 13 pM innerhalb von 2,1 h ohne den Einsatz von hochqualifiziertem Personal nachweisen.
Kapitel 4.2 beschreibt das zweite Verfahren, das einen mehrfachen sequentiellen Betrieb der Re-Suspension von Mikropartikeln, die Trennung von Mikropartikeln von Flüssigkeiten, den Transport von Mikropartikeln und die Flüssigkeitsführung beinhaltet. Das Verfahren integriert einen mikrofluidischen Timer mit zwei Siphons. Die Partikelresuspendierung wird im mikrofluidischen Timer durch Schüttelmodus erreicht, und der Timer definiert genau die Zeit der Partikelresuspendierung. Mehr als 93 % der sedimentierten Partikel können resuspendiert werden. Die Abtrennung der Partikel aus der Flüssigkeit erfolgt durch Sedimentation der Partikel und anschließende Entfernung des Überstandes. Der Partikelverlust bei der Abtrennung von Partikeln aus der Flüssigkeit liegt unter 7 % und die in den Partikeln verbleibende Restflüssigkeit unter 0,5 %. Zeitlich werden die Partikel 59 % der Zeit in einem Mischzyklus resuspendiert. Die beiden Siphons ermöglichen die Führung von Flüssigkeits- oder Partikelsuspensionen durch den gewählten Weg, indem sie einfach die Beschleunigungsrate steuern. Die sedimentierten Partikel können resuspendiert und zusammen mit dem flüssigen Trägermedium über einen definierten Fluidweg mit einem Partikelverlust von unter 7 % transportiert werden. Durch die Auslösung nur des unteren Siphons strömt die Flüssigkeit in eine Abfallkammer. Um Flüssigkeits- oder Mikropartikel über einen anderen Fluidweg zu leiten, können sowohl der untere Siphon als auch der obere Siphon gleichzeitig ausgelöst werden. Durch die hohe Fluidbeständigkeit im unteren Siphon können bis zu 98 % der Flüssigkeit durch den oberen Siphon transportiert werden.
Die letzte in Kapitel 4.3 vorgeschlagene Methode kann die Trennung von Mikropartikeln vom flüssigen Trägermedium, die Re-Suspension von Mikropartikeln und eine hocheffiziente Flüssigkeitsführung durchführen. Wie das zweite Verfahren integriert auch dieses Verfahren einen mikrofluidischen Timer mit zwei Siphons. Die Partikelbehandlung erfolgt jedoch in einer Einlasskammer anstelle des mikrofluidischen Timers. Der Timer wird hier nur für die Siphonansaugung verwendet. Somit ist die Zeit der Partikelaufsuspension nicht mehr begrenzt durch den Mikrofluidik-Timer. Theoretisch können alle Partikel im Shake-Modus bei niedrigen Drehzahlen resuspendiert werden. Der Partikelverlust bei der Trennung von Partikeln aus der Flüssigkeit liegt unter 4 % und die in den Partikeln verbleibende Restflüssigkeit unter 3,5 %. Zeitlich können die Partikel ohne zeitliche Begrenzung wieder suspendiert werden. Die neuartige Doppel-Siphon-Konfiguration ermöglicht eine 100-prozentige Flüssigkeitsführung über zwei Fluidwege zu zwei verschiedenen Kammern. Es können auch mehrere aufeinanderfolgende Operationen durchgeführt werden. Basierend auf diesem Verfahren wird ein vollautomatisches zentrifugales mikrofluidisches Verfahren für partikelbasierte Proteinimmunoassays demonstriert in Kapitel 6.1. Die Stick-Pack-Technologie wird zur Vorlagerung und Freigabe von Flüssigreagenzien eingesetzt. Funktionalisierte Mikropartikel werden als getrocknetes Pellet vorgelagert. Das automatisierte Immunoassay-Konzept besteht aus On-Demand-Ligandenbindung, zwei Waschschritten, der Substratreaktion, der zeitgesteuerten Trennung der Reaktionsprodukte und der Beendigung der Substratreaktion. Das automatisierte Immunoassay-Konzept wurde durch den Nachweis von C-reaktivem Protein (CRP) im Bereich von 1-81 ng ml-1 und Interleukin 6 (IL-6) im Bereich von 64-13500 pg ml-1 nachgewiesen. Die Nachweis- und Quantifizierungsgrenze lag bei 1,0 ng ml-1 und 2,1 ng ml-1 für CRP und 64 pg ml-1 und 205 pg ml-1 für IL-6

Angaben zum Objekt

• Standort: Deutsche Nationalbibliothek Frankfurt am Main
• Umfang: Online-Ressource
• Sprache: Englisch
• Anmerkungen: Universität Freiburg, Dissertation, 2019

Klassifikation und Themen

• Klassifikation: Physik
• Schlagwort: Mikrofluidik ; Mikropartikel

Beteiligte, Orts- und Zeitangaben

• Ereignis: Veröffentlichung
• (wo): Freiburg
• (wer): Universität
• (wann): 2020
• Urheber: Zhao, Yunpeng
• Beteiligte Personen und Organisationen: Zengerle, Roland ; Albert-Ludwigs-Universität Freiburg. Fakultät für Angewandte Wissenschaften

Weitere Informationen

• DOI: 10.6094/UNIFR/151805
• URN: urn:nbn:de:bsz:25-freidok-1518054
• Rechteinformation: Der Zugriff auf das Objekt ist unbeschränkt möglich.
• Letzte Aktualisierung: 25.03.2025, 13:48 MEZ