Centrifugal microfluidics for nucleic acid analysis at the point-of-care

Hochschulschrift

Zusammenfassung: Die Analyse von Nukleinsäuresequenzen ist die Grundlage für die Einleitung von evidenzbasierten Therapien vieler infektions-, genetisch und erblich bedingter Krankheiten insbesondere wenn sich diese durch eine unspezifische Symptomatik präsentieren oder Sequenzmuster auf dem Nukleinsäurestrang mit einem pathogenen Befund assozziert sein können. Konventionellen, kulturbasierten Verfahren ist die Nukleinsäureanalytik vor allem durch eine höhere Spezifizität und eine geringere Analysezeit überlegen. Für zeitkritische Fragestellungen und in Umgebungen, in denen kein Zugang zu einer zentrallabor-basierten Diagnostik besteht, wäre eine Durchführung der Analyse am sogenannten Point-of-Care wünschenswert. Die Vielzahl der erforderlichen Einzelschritten wie Zelllyse, Nukleinsäureaufreinigung, Amplifikation und Detektion, erschwert jedoch eine Automatisierung der Analyse erheblich. Aus diesem Grund sind erst wenige Point-of-Care Systeme am Markt verfügbar. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung einer zentrifugal-mikrofluidischen Kartusche für die Nukleinsäureanalytik die potentiell am Point-of-Care eingesetzt werden kann. Um dieses Ziel zu erreichen wurden mehrere Teilziele einschließlich der Entwicklung von zentrifugal-mikrofluidischen Prozessketten zur Nukleinsäureextraktion und Amplifikation definiert. Anschließend wurden die entwickelten Prozessketten gemeinsam in eine Kartusche integriert um den vollständigen Ablauf der Analyse von der Probenaufgabe bis zum Ergebnis automatisiert abzubilden. Zu Beginn wurde eine mikrofluidische Einheitsoperation zum Transport magnetischer Partikel zwischen mehreren mikrofluidischen Kammern entwickelt. Der Transport der Partikel basierte in dieser Entwicklung auf der einfachen azimuthalen Positionierung der Kartusche bezüglich eines externen und stationären Permanentmagneten, dem „Transport-Magneten“. Mit diesem Aufbau war es möglich, die mikrofluidischen Kammern auf der Kartusche isoradial anzuordnen um so eine grundlegende Limitierung für die Integration komplexer Analyseprozeduren auf der zentrifugalen Mikrofluidik, die Anordnung aufeinander folgender Prozessschritte in radiale Richtung, zu umgehen. Nach dem Transport durch drei mikrofluidische Kammern wurde die Ausbeute der Beads in der letzten Kammer zu 82.6 % ± 3.6 % bestimmt. Mit der entwickelten Einheitsoperation konnte anschließend DNA aus Listeria innocua Lysaten und Lambda phagen mit einer Ausbeute von 68 % ± 24 % bzw. 43 % ± 10 %, verglichen mit der manuellen Referenz, aufgereinigt werden. Anschließend wurde die Einheitsoperation durch einen zweiten externen Permanentmagneten, den „Sammel-Magneten“, erweitert um die Beads in Flüssigkeitsvolumen von bis zu 1 mL zu sammeln bevor sie vom Transportmagneten aus der Flüssigkeit in die benachbarte Kammer transportiert wurden. Mit dem so verbesserten Aufbau wurde eine Nukleinsäureextraktion bestehend aus Zelllyse und nachgeschalteter Aufreinigung aus Vollblut und verschiedenen Pathogenen gespiked in verschiedene Probenmatrizen wie Blutplasma und Nährmedium durchgeführt. Als Probe wurden dekadische Verdünnungen von Gram-positiven Bacillus subtilis und Gram-negativen Escherichia coli verwendet und die Ausbeuten der DNA Extraktion zu 58.2 % - 98.5 % bzw. 45.3 % - 102.1 % bestimmt. RNA wurde aus dekadischen Verdünnungsreihen von Rift Valley Fever RNA Viren mit Ausbeuten zwischen 29.5 % und 34.2 % verglichen mit der manuellen Referenz extrahiert. Die Extraktion humaner DNA aus Vollblut lieferte in der disk-basierten Aufreinigung vergleichbare Ergebnisse wie die manuelle Referenz ((10.1 ± 7.6 ) x 104 bzw. (10.2 ± 6.3) x 104 DNA Kopien). Die Prozesskette zur Nukleinsäureextraktion wurde vollautomatisch in ca 30 Minuten (inkl. 15 Minuten Lysezeit) durchgeführt. In weiteren Arbeiten wurde ein zentrifugal-mikrofluidisches Disk-Segment ‚Gene-Slice‘ für den Nachweis der 7 wichtigsten KRAS Punktmutationen entwickelt. KRAS Mutationen mit einer Prävalenz von bis zu 40 % etwa in Karzinomen des Colorectums haben einen erheblichen Einfluss auf den Erfolg einer antikörperbasierten Krebstherapie. Für den Nachweis der Punktmutationen wurde ein allel-spezifischer real-time PCR assay implementiert, der sich Unterschiede in der Amplifikationseffizienz zunutze macht, die aus der Übereinstimmung der DNA und dem allel-spezifischen Primer am 3‘ Ende resultieren. Im Vergleich mit routinemäßig eingesetztem Dideoxy-Sequenzieren (Dauer ~ 20 Stunden) würde der Nachweis der Mutationen mittels allel-spezifischer real-time PCR ( ~ 2 Stunden) einen erheblichen zeitlichen Vorteil mit sich bringen. Zunächst wurde nachgewiesen, dass die Intrachip Variation der Cq Werte für die gleichzeitige Amplifikation von DNA in allen 8 Amplifikationskammern des GeneSlice vernachlässigbar klein ist (Cq StdAbw = 0.13 and 0.26). Anschließend wurde DNA aus 6 Zelllinien in Vierfachbestimmung analysiert. Mit dem GeneSlice konnte der Genotyp in 23 von 24 durchgeführten Experimenten korrekt bestimmt werden. In Experimenten mit DNA aus zwei Patientenproben konnte in allen Replikaten der korrekte Genotyp in Übereinstimmung mit dem Sequenzierergebnis festgestellt werden. Um den Empfehlungen der MIQE Richtlinien (Minimum information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments [1]) zu entsprechen wurde in einem weiteren Arbeitspaket ein mikrofluidisches System für die Integration von Positive- und No-template Kontrollen am Beispiel des Nachweises von verschiedenen Lebensmittelpathogenen wie Salmonella, Listeria oder Campylobacter gezeigt. Das mikrofluidische System beinhaltet eine Einheitsoperation für das sequentielle Aliquotieren von zwei Flüssigkeiten mit höchst unterschiedlichen Benetzungseigenschaften in 14 Teilvolumen mit aliquotierten Volumen von 5.8 μL ± 0.3 μL (PCR mastermix) und 6.1 μL ± 0.8 μL (Elutionspuffer). Im qualitativen Betrieb konnten 10 pg, 1 pg und 0.1 pg DNA jedes Pathogens nachgewiesen warden. Im quantitativen Betrieb wurden mit Hilfe von disk-integrierten PCR Standards 50 pg und 500 pg Listeria monocytogenes DNA zu 83 ± 17 pg bzw. 540 ± 116 pg quantifiziert und 50 pg und 500 pg von Staphylococcus aureus DNA zu 48 ± 4 pg bzw. 643 ± 211 pg. Final wurden die entwickelten Prozessketten zur Nukleinsäureextraktion und Multiplexamplifikation auf einer zentrifugal-mikrofluidischen Kartusche gemeinsam ko-integriert um den gesamten Ablauf von der Probenaufgabe bis zum Ergebnis automatisierenPage xizu können. Diese Kartusche konnte in einem kleinen, portablen Basisgerät (25 x 17.5 x 8.5 cm³; Gewicht < 2 Kg) prozessiert werden. Anstelle von PCR wurde für die komplett automatisierte Analyse ein isothermales Amplifikationsverfahren, die Recombinase Polymerase Amplifikation (RPA), zur Amplifikation der DNA ausgewählt. Mit diesem Aufbau konnte die Machbarkeit anhand des Nachweises von Bacillus anthracis, Yersinia pestis und Francisella tularensis gezeigt werden. Die Pathogene waren hierfür in Blut-Plasma gespiked. Die Gesamteanalysezeit von der Probenaufgabe bis zum Ergebnis lag unter 45 Minuten. In Folgeexperimenten stellte sich jedoch die Reproduzierbarkeit und Interpretierbarkeit der Fluoreszenzsignale als problematisch heraus. Als ein Hauptgrund konnte die Degradierung der RPA Sonde identifiziert werden.Weiteres Verbesserungspotential liegt in der Ausstattung der Kartusche mit einer integrierten Flüssigreagenzienvorlagerung und der Durchführung von umfangreichen Lagerungs- und Stabilitätsuntersuchungen. Durch diese Verbesserungen könnte auch gering geschultes Personal befähigt werden, komplexe Nukleinsäureanalytiken direkt am Point-of-Care durchzuführen
Zusammenfassung: The analysis of nucleic acids is an essential pre-requisite for initialisation of evidence based therapy of many genetic, inherited or infectious diseases in which the presentation of the clinical symptoms is non-specific or certain sequence patterns on the nucleic acid strand are associated with a pathological indication. Compared to conventional culture based methods, nucleic acid analysis provides an obvious benefit in specificity and reduction in time-to-result. In time-critical situations and in settings where access to centralized labora-tories for sample analysis is limited, nucleic acid analysis, conducted directly at the “point-of-care” would be desired. However, the complex workflow for analysis, typically comprising cell lysis, nucleic acid purification, amplification and detection, hinders the automation in portable systems and consequently only few point-of-care systems are available.Aim of this thesis was the development of a centrifugal microfluidic cartridge for nucleic acid analysis that potentially could be operated at the point-of-care. To achieve this goal, several sub-goals including the development of a process chains for nucleic acid extraction and for multiplex nucleic acid amplification were defined. These process chains were finally co-integrated on one cartridge for sample-to-answer nucleic acid analysis.Initially, a unit operation for transportation of magnetic beads between several microfluidic chambers was developed. Here, bead transport was solely depending on the azimuthal position of the cartridge with respect to a locally fixed, external permanent magnet, ‘transport magnet’. This implementation allowed an isoradial arrangement of the microfluidic chambers thereby circumventing one of the basic limitations for integration of complex assays on the centrifugal microfluidic cartridge: the arrangement of consequtive assay steps in radial direction from the cartridge center towards the rim. Yield of bead transport through three microfluidic chambers was measured to 82.6 % ± 3.6 %. With this unit operation, DNA from Listeria innocua lysates and lambda phages was purified with recoveries of up to 68 % ± 24 % and 43 % ± 10 %, respectively, compared to manual reference. The unit-operation was then completed by a second external permanent magnet, ‘collection magnet’, to collect beads in liquid volumes as large as 1 mL before they are transported out of the liquid into the adjacent microfluidic chamber by the ‘transport magnet’. This improved version was then used for nucleic acid extraction, comprising cell lysis and nucleic acid purification, from various target cells and pathogens spiked in different sample matrices such as whole blood, blood plasma and culture media. DNA has been extracted from logarithmic dilutions of Gram-positive Bacillus subtilis and Gram-negative Escherichia coli with recoveries of 58.2 % - 98.5 % and 45.3% - 102.1 %, respecitively. RNA extraction from logarithmic dilutions of Rift Valley Fever virus spiked in blood plasma yielded between 29.5 % and 34.2 % compared to manual reference while recovery of human DNA from whole blood resulted in equivalent recoveries on-disk and in manual referencePage viiiextraction ((10.1 ± 7.6) x 104 versus (10.2 ± 6.3) x 104 DNA copies). The process chain was conducted fully automatically within ~ 30 minutes including 15 minutes lysis time.Next, a centrifugal microfluidic disk-segment termed GeneSlice was developed for the detection of the 7 most relevant KRAS point mutations. KRAS mutations are prevalent in up to 40 % of all colorectal carcinomas and the mutation criticially effects cancer therapy. The detection was conducted by allele-specific real-time PCR exploiting the differences in amplification efficiencies between perfect or non-perfect primer match at the 3’ primer terminal. Allele-specific real-time PCR would provide a benefit in time to result (~ 2 hours) compared to dideoxy sequencing (~ 20 hours) currently conducted in routine diagnostics. Intra-chip standard deviation of Cq values for parallel amplification in all eight amplification chambers of a GeneSlice was negligible (Cq std. dev = 0.13 and 0.26) . To prove feasibility, DNA from 6 cell lines in replicates of 4 has been analysed on the GeneSlices resulting in correctly genotyped mutation in 23 out or 24 cases. Finally, DNA from two human colorectal carcinoma samples was analysed showing full consistency with results from sequencing. Furthermore, a process chain for the parallel real-time PCR based detection of DNA from six common food pathogens, including Salmonella, Listeria and Campylobacter, via real-time PCR was developed. The implementation of the process chain included integrated positive and no-template controls to be in compliance with the MIQE guidlines (Minimum information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments [1]). Additionally, a unit operation for sequential aliquoting of two liquids with highly different wetting characteristics into 14 aliquots with aliquoted volumes of 5.8 μL ± 0.3 μL (PCR mastermix) and 6.1 μL ± 0.8 μL (elution buffer) has been developed and integrated. In a qualitative operation mode quantities of 10 pg, 1 pg and 0.1 pg DNA of each food pathogen were detected successfully. In a quantitiatve mode, cartridge-integrated PCR standards were used to quantify 50 pg and 500 pg of Listeria monocytogenes DNA to 83 ± 17 pg and 540 ± 116 pg DNA while 50 and 500 pg of Staphylococcus aureus DNA were quantified to 48 ± 4 pg and 643 ± 211 pg. Finally, the process chains for nucleic acid extraction and multiplex amplification were co-integrated on one centrifugal microfluidic cartridge for full sample-to-answer nucleic acid analysis. The cartridge could be processed in a small and portable processing device (size: 25 x 17.5 x 8.5 cm³, weight < 2 kg). Instead of PCR, isothermal recombinase polymerase amplification (RPA) was used to amplify the DNA. Proof-of-principle was conducted for Bacillus anthracis, Yersinia pestis and Francisella tularensis spiked in blood plasma in less then 45 minuts from sample addition to positive amplification. However, amplification showed unreliable, hard-to-interpret fluorescence signals during real-time amplification. As the cause, the degradation of the RPA probe has been identified.Further potential for improvements includes the integration of liquid reagent prestorage on the cartridge. The prestorage of all reagents would reduce the number of manual preparation steps as the user only has to add the sample and start the analysis. However, reagent prestorage would require comprehensive shelf-live studies. These potential improvements would allow even untrained users to conduct complex nucleic acid analysis in point-of-care settings were access to medical diagnostics is currently not available

Angaben zum Objekt

• Standort: Deutsche Nationalbibliothek Frankfurt am Main
• Umfang: Online-Ressource
• Sprache: Englisch
• Anmerkungen: Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, Dissertation, 2016

Klassifikation und Themen

• Schlagwort: Krebs ; Onkologie

Beteiligte, Orts- und Zeitangaben

• Ereignis: Veröffentlichung
• (wo): Freiburg
• (wer): Universität
• (wann): 2016
• Urheber: Strohmeier, Oliver
• Beteiligte Personen und Organisationen: Zengerle, Roland

Weitere Informationen

• DOI: 10.6094/UNIFR/10874
• URN: urn:nbn:de:bsz:25-freidok-108743
• Rechteinformation: Der Zugriff auf das Objekt ist unbeschränkt möglich.
• Letzte Aktualisierung: 25.03.2025, 13:44 MEZ