A microfluidic dual chip system for rapid pathogen detection

Hochschulschrift

Zusammenfassung: “If time be of all things the most precious, wasting time must be the greatest prodigality.” Benjamin Franklin (1706 – 1790)Conventional pathogen detection methods are time consuming, cost intensive and require skilled laboratory workers. Today the standard method is still culturing and plating where results might take several days. However, recent outbreaks of diseases like EHEC or Ebola point out that neither time nor capabilities for such procedures are sufficiently available at any time.In order to effectively approach this problem one possible way is automated and more rapid pathogen detection in a lab-on-a-chip format. The findings from this thesis demonstrate single aspects of such a system, which in combination allow functioning pathogen detection in a point of care device.For this purpose firstly a microfluidic chip concept and a detection strategy are elaborated. The technical implementation of the sample preparation chip, the integrated pumping mechanism and the detection apparatus are completed as work packages within bachelor’s or master’s theses. The emphases of this work lie in the integration of the Fenton reaction as part of the sample preparation, the chip-implementation and application of phaseguide-based mixing for the detection reaction and the expansion of the overall concept on further targets.For the sample preparation module two microfluidic chips are combined so that bacterial accumulation, cell lysis and RNA purification is possible successively on a single chip. For an improved chip operation, an adaptable holder is built with exchangeable fluidic and electric connections. The holder fits under a fluorescence microscope so that fluidic processes and operations like cell lysis are made directly observable.The necessary purification step for sample preparation uses miniaturised gel electrophoresis. Usually long nucleic acid molecules are retained within the hydrogel so that just short RNAs can be purified. This thesis presents a method for cell lysis and simultaneous non-enzymatic DNA cleavage. Here the Fenton reaction is utilized for nucleic acid fragmentation prior to the purification step. In contrast to restriction enzymes this chemical reaction cleaves DNA independent from nucleotide sequences. The degree of fragmentation can be adjusted by the concentration of reagents. These results enable electrophoretic extraction methods to process long nucleic acids such as genomic DNA within a short time frame.As a link-up module to sample preparation a nucleic acid detection chip is introduced which implements the isothermal recombinase polymerase amplification (RPA). Similar to PCR, specific primers and fluorescent probes are used to target and to detect a particular base sequence. A maze-like mixing structure is developed for the necessary mixing procedure of RPA detection reagents with a purified nucleic acid solution. Within a microfluidic chamber this structure allows passive laminar flow mixing of two 6.5 μl liquid batches differing in viscosity. Here phaseguide technology is applied for filling a chamber in a more complex and sophisticated manner than it was possible before. Thus a passive mixing structure can be integrated for the first time directly into a target chamber in order to save space.Furthermore a new detection device is built for real-time fluorescence readout directly from the chip. For that purpose the microfluidic chip inside of the device is kept at the required constant temperature for the RPA while a fluorescence detector measures the assay’s amplification signal.In lab-on-a-chip devices often syringe pumps are applied for fluid transport. As an integrated alternative this thesis demonstrates an electrochemical pumping solution which, in combination with a passive cut-off valve, is able to transport metered liquid batches from chamber to chamber.Hence in summary nucleic acids can be extracted from a bacterial sample and subsequently be detected specifically. All necessary single steps for nucleic acid based pathogen detection on chip are demonstrated in proof of principle tests. The performed chip operations in combination with the compact readout device open up the way towards a fully integrated pathogen detection system in a lab-on-a-chip format for point of care applications. For further application possibilities the system is broadened on eukaryotic cells as well. As proof of principle microRNAs are extracted from tumour cells
Zusammenfassung: “Ist die Zeit das Kostbarste unter allem, so ist die Zeitverschwendung die allergrößte Verschwendung.” Benjamin Franklin (1706 – 1790)Konventionelle Methoden zur Pathogendetektion sind zeitaufwendig, kostenintensiv und benötigen ausgebildetes Laborpersonal. Die heutige Standardmethode ist dabei immer noch das Kultivieren und Ausplattieren, bei der es mehrere Tage dauern kann bis ein Ergebnis feststeht. Dass aber weder die Zeit noch die Ressourcen hierfür immer im ausreichenden Umfang zur Verfügung stehen, wird bei Krankheitsausbrüchen, wie die von EHEC und Ebola, deutlich.Ein möglicher Weg, dieser Problematik effektiv zu begegnen ist eine automatisierte und schnellere Pathogendetektion im Lab-on-a-Chip Format. Die Erkenntnisse dieser Dissertation zeigen einzelne Aspekte eines solchen Systems, die in Kombination eine funktionierende Pathogendetektion in einem Point-of-care Gerät ermöglichen.Dafür erfolgt zunächst die Ausarbeitung eines mikrofluidischen Chip-Konzepts und einer Detektionsstrategie. Die technische Umsetzung des Probenvorbereitungschips, des integrierten Pumpmechanismus und der Detektionsapparatur werden dabei als Arbeitspakete in Bachelor- und Masterarbeiten absolviert. Schwerpunkte dieser Arbeit sind die Integration der Fenton Reaktion als Teil der Probenvorbereitung, die Chip-Umsetzung und Anwendung der phaseguide-basierten Durchmischung für die Detektionsreaktion und die Ausdehnung des Gesamtkonzepts auf weitere Targets.Für das Probenvorbereitungsmodul werden zwei mikrofluidische Chips so kombiniert, dass eine Akkumulation von Bakterien, Zelllyse und RNA Aufreinigung auf einem einzigen Chip sukzessiv möglich ist. Für einen optimierten Chipeinsatz wurde eine adaptierbare Halterung mit austauschbaren fluidischen und elektrischen Anschlüssen konstruiert. Diese passt auf ein Fluoreszenzmikroskop, sodass fluidische Prozesse und Vorgänge, wie die Zelllyse, direkt beobachtbar werden.Der notwendige Aufreinigungsschritt der Probenvorbereitung geschieht dabei durch miniaturisierte Gelelektrophorese. Gewöhnlich werden hier lange Nukleinsäuremoleküle im Hydrogel zurückgehalten, sodass nur kurze RNAs aufgereinigt werden können. Diese Dissertation zeigt eine Methode zur Zelllyse und gleichzeitiger nicht-enzymatischer DNA Spaltung. Hierbei wird die Fenton Reaktion zur Nukleinsäurefragmentierung vor dem Aufreinigungsschritt angewandt. Im Gegensatz zu Restriktionsenzymen spaltet diese chemische Reaktion DNA sequenzunabhängig. Der Grad der Fragmentierung kann dabei über die Reagenzkonzentrationen eingestellt werden. Diese Ergebnisse ermöglichen es elektrophoretischen Extraktionsmethoden nun ebenfalls lange Nukleinsäuren, wie genomische DNA, in kurzer Zeit zu prozessieren.Als Anschlussmodul an die Probenvorbereitung wird ein Nukleinsäure-Detektionschip vorgestellt, der die isotherme Recombinase Polymerase Amplifikation (RPA) implementiert. Dafür werden, ähnlich der PCR, spezifische Primer und Fluoreszenzsonden verwendet, um an eine bestimmte Basenpaarfolge zu binden und diese zu detektieren. Für die bei der RPA erforderliche Vermischung von Detektionsreagenzien mit einem aufgereinigten Nukleinsäureeluat wird dabei eine labyrithartige Mischstruktur entwickelt. Diese ermöglicht es, zwei 6,5 μl Flüssigkeitsvolumina von unterschiedlicher Viskosität bei laminarer Strömung in einer mikrofluidischen Kammer passiv zu vermischen. Dabei wird die Phaseguidetechnologie angewandt, um das Befüllen einer Kammer in einer komplexeren Weise durchzuführen als es zuvor möglich war. Dadurch wird es zum ersten Mal möglich, eine Mischstruktur platzsparend direkt in eine Zielkammer zu integrieren.Des Weiteren wird ein neues Detektionsgerät konstruiert, um eine Echtzeit-Fluoreszenz-Ausgabe direkt vom Chip durchzuführen. Hierfür wird im Inneren des Detektionsgerätes der mikrofluidische Chip auf der für die RPA benötigten konstanten Temperatur gehalten, während ein Fluoreszenzdetektor das Amplifikationssignal misst.Für den Fluidtransport kommen in Lab-on-a-Chip Systemen häufig Spritzenpumpen zum Einsatz. Als integrierte Alternative wird in dieser Arbeit eine elektrochemische Pump-Lösung aufgezeigt, welche, mit einem passiven Dosierventil ausgestattet, abgemessene Flüssigkeitsvolumina von Kammer zu Kammer transportieren kann.Somit können insgesamt Nukleinsäuren aus einer bakteriellen Probe extrahiert und anschließend spezifisch detektiert werden. Sämtliche notwendigen Einzelschritte für eine nukleinsäure-basierte Pathogendetektion auf einem Chip sind als Proof-of-Principle gezeigt. Die durchgeführten Chipanwendungen in Kombination mit dem kompakten Auslesegerät zeigen einen Weg zu einem vollintegrierten Pathogendetektionssystem im Lab-on-a-Chip Format für Point-of-Care Anwendungen auf. Für weitere Applikationsmöglichkeiten des Systems wird es auch auf eukaryotische Zellen erweitert. Als Proof-of-Principle hierfür werden microRNAs aus Tumorzellen extrahiert

Angaben zum Objekt

• Standort: Deutsche Nationalbibliothek Frankfurt am Main
• Umfang: Online-Ressource
• Sprache: Englisch
• Anmerkungen: Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, Dissertation, 2015

Klassifikation und Themen

• Klassifikation: Biowissenschaften, Biologie
• Schlagwort: Mikrofluidik ; Lab on a Chip ; miRNS ; Elektrophorese ; Mikrosystemtechnik

Beteiligte, Orts- und Zeitangaben

• Ereignis: Veröffentlichung
• (wo): Freiburg
• (wer): Universität
• (wann): 2015
• Urheber: Hakenberg, Sydney
• Beteiligte Personen und Organisationen: Urban, Gerald A.

Weitere Informationen

• DOI: 10.6094/UNIFR/10367
• URN: urn:nbn:de:bsz:25-freidok-103676
• Rechteinformation: Der Zugriff auf das Objekt ist unbeschränkt möglich.
• Letzte Aktualisierung: 14.08.2025, 10:49 MESZ