Bakterielle deamidierende Toxine : : funktionale Charakterisierung des Zytotoxisch nekrotisierenden Faktor S und Identifizierung essentieller Wirtszellfaktoren des Pasteurella multocida Toxins

Abstract: This study investigates toxin-host-interactions of the bacterial deamidating toxins Cytotoxic necrotizing factor S and Pasteurella multocida toxin. These two virulence factors belong to the dermonecrotic toxin family and act as intracellular toxins. By deamidation of a crucial glutamine residue in G-proteins they render them constitutively active. Through this covalent modification they’re able to impair various signaling pathways and thereby manipulate central functions of the host cell by posttranslational modification of GTP-binding proteins. The purpose of these secreted Toxins is the adaption of pathogens to their host environment.
The goal of the first part of this study was the recombinant expression and characterization of the
potential deamidating toxin Cytotoxic necrotizing factor S (CNFS). The sequence of the toxin was found in a probably human pathogenic Salmonella enterica strain. In vitro CNFS showed deamidase- as well as transglutaminase-activity on proteins of the Rho-family. Effector-protein pulldowns in eukaryotic cells revealed RhoA, Rac1 and Cdc42 as intracellular substrates of the toxin. The substrates were confirmed by observation of the characteristic morphological changes of the actin cytoskeleton. Linkedto the organization of the actin cytoskeleton is the regulation of tight junction structures and the related endothelial/epithelial integrity. CNFS showed a moderate impairment of the endothelial barrier in HUVEC (human umbilical vein endothelial cells) cells. In addition to the functional characterization of the toxin a focus was given to the toxin-host cell interaction. By using flow cytometry, native gelelectrophoresis, immunoblotting, and knockout-cell lines, Heparansulfate proteoglycans (HSPG) were identified as crucial host cell factors for a sufficient intoxication by CNFS. In HSPG-deficient cells diminished binding of the toxin to the cell surface was observed and no responsivity to the Rho Deamidation of CNFS was detectable.
The second part of the thesis deals with the main virulence factor Pasteurella multocida toxin (PMT) of the animal pathogen Pasteurella multocida. As a typical AB-toxin PMT consists of a N-terminal receptor binding domain and a C-terminal catalytic domain. The N-terminus mediates the binding to the cell surface and the subsequent receptor-mediated endocytosis, whereas the C-terminus deamidates the α-subunit of heterotrimeric G-proteins. Via a genome-wide CRISPR-Knockout screen the Low-Density Lipoprotein Receptor-Related Protein-1 (LRP1) was found to act as host cell receptor for PMT. In cells lacking LRP1 expression PMT showed no deamidation. By ectopic reexpression of single domains of LRP1, the role of the receptor was confirmed and the binding domain was found to be located in the cluster IV of the protein. On the basis of the residual binding of the DyLight488-labeled toxin to the LRP1-KO cells the necessity of other structures on the cell surface for an appropriate binding can be assumed.
In summary in this work the new virulence factor CNFS of a human pathogenic Salmonella enterica strain was identified and characterized. Moreover, LRP1 was found as a crucial host cell receptor of PMT. The results of this work provide the basis for a better understanding of the pathogenesis of salmonellosis and pasteurellosis
Abstract: In der vorliegenden Arbeit wurde die Toxin-Wirtszell-Interaktion der bakteriellen Toxine Zytotoxisch
nekrotisierender Faktor S (CNFS) und Pasteurella multocida Toxin (PMT) näher untersucht. Die beiden Virulenzfaktoren zählen zu den dermonekrotischen Toxinen und sind in der Lage essentielle Proteine innerhalb der Wirtszelle posttranslational durch Deamidierung zu modifizieren. Durch Deamidierung von Proteinen aus der Familie der GTP-bindenden Proteine nehmen sie Einfluss auf die Regulation wichtiger zellulärer Funktionen. Dies geschieht letztlich im Rahmen einer Anpassung des Pathogens an die Bedingungen im Wirtsorganismus während einer Infektion.
Der erste Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der erstmaligen rekombinanten Expression eines potentiell deamidierenden Toxins eines humanpathogenen Salmonella enterica -Stammes und der damit verbundenen funktionsmechanistischen Charakterisierung des Zytotoxisch nekrotisierenden Faktor S (CNFS). In in vitro Versuchen zeigte das Toxin deamidierende als auch transglutaminierende Aktivitätan Proteinen der Rho-Familie. In Säugerzellen konnten mit Hilfe sogenannter Effektorprotein-Pulldown-Experimente RhoA, Rac und Cdc42 als intrazellulär modifizierte Substrate des Toxins identifiziert werden. Über morphologische Veränderungen des Aktin-Zytoskeletts konnten die modifizierten Substrate von CNFS bestätigt werden. Auch die mit dem Aktin-Zytoskelett direkt in Zusammenhang stehende Regulation von tight junction -Strukturen und die damit verbundene endotheliale/epitheliale Integrität wurde in Abhängigkeit des Toxins getestet. CNFS zeigte im Rahmen von Messungen der Trans-endothelialen elektrischen Resistenz eine deutliche Beeinträchtigung der Barrierefunktion im endothelialen Zellmodell. Neben der funktionalen Charakterisierung wurde auch die Toxin-Wirtszellinteraktion näher untersucht. Mittles durchflusszytometrischer Experimente, Immunoblots, nativer Gelelektrophorese und Deletions-Zelllinien konnten Heparansulfatproteoglykane (HSPG) als essentielle Wirtszellfaktoren für die Vergiftung mit CNFS identifiziert werden. HSPG-defiziente Zellen zeigten eine stark reduzierte Bindung des Toxins an die Zelloberfläche und waren nicht mehr responsiv für die Rho-Deamidierung durch CNFS.
Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit dem Pasteurella multocida Toxin, dem Hauptvirulenzfaktor des gleichnamigen tierpathogenen Bakteriums Pasteurella multocida. Um ins Zellinnere zu gelangen muss das Toxin die Wirtszellmembran überwinden. Als klassisches AB-Toxin ist PMT aus einer N-terminalen Rezeptorbinde- und Translokationsdomäne und einer C-terminalen katalytischen Domäne aufgebaut. Während der N-Terminus die Bindung an die Zelloberfläche und anschließende Rezeptor-vermittelte Endozytose initiiert, ist der katalytische C-Terminus dazu in der Lage α-Untereinheiten heterotrimerer G-Proteine zu deamidieren. Mittels eines Genom-weiten CRISPR-Knockout-Screens war es möglich Low Density Lipoprotein Receptor-Related Protein-1 (LRP1) als zellulären Wirtszellrezeptor für PMT zu identifizieren. In Vergiftungsversuchen von Zellen mit fehlender LRP1-Expression war keine Deamidierung durch PMT zu detektieren. Über Rescue-Versuche und ektopischer Reexpression einzelner Rezeptordomänen, konnte die Rolle von LRP1 bestätigt werden und die Bindungsstelle des Toxins auf das Cluster IV eingegrenzt werden. Aufgrund einer Restbindung von Fluoreszenz-markiertem PMT an LRP1-defiziente Zellen, ist jedoch von weiteren relevanten Strukturen auf der Zelloberfläche für die Bindung und Aufnahme von PMT auszugehen.
Zusammengefasst wurde in dieser Arbeit erstmals ein neuer Virulenzfaktor (CNFS) eines humanpathogenen Salmonella-Stammes identifiziert und charakterisiert. Des Weiteren war es möglich LRP1 als Wirtszellrezeptor für PMT zu identifizieren. Die Ergebnisse dieser Arbeit bieten die Grundlage für ein besseres Verständnis der Pathogenese von Salmonellosen und Pasteurellosen

Object Details

• Location: Deutsche Nationalbibliothek Frankfurt am Main
• Extent: Online-Ressource
• Language: Deutsch
• Notes: Universität Freiburg, Dissertation, 2022

Classification and Topics

• Keyword: Bakteriengift ; Pasteurella multocida ; Escherichia coli ; Deamidierung ; Virulenzfaktor ; Pathophysiologie ; Toxin ; Pasteurella multocida ; Salmonella

Contributors, Places and Time

• Event: Veröffentlichung
• (where): Freiburg
• (who): Universität
• (when): 2022
• Creator: Schöllkopf, Julian
• Contributor: Schmidt, Gudula ; Bechthold, Andreas ; Schmidt, Gudula ; Albert-Ludwigs-Universität Freiburg. Fakultät für Chemie und Pharmazie

Further information

• DOI: 10.6094/UNIFR/226071
• URN: urn:nbn:de:bsz:25-freidok-2260718
• Rights: Open Access; Der Zugriff auf das Objekt ist unbeschränkt möglich.
• Last update: 25.03.2025, 1:54 PM CET