Functional and structural investigation of the Archaeglobus fulgidus Amt1

Abstract: Ammonium Transportproteine (Amt) und ihren Homologen von Säugetieren, Rhesusproteinen, bilden die Amt/Rh Proteinfamilie. Die Amt/Rh Proteinfamilie ist verantwortlich für den selektiven Transport von Stickstoff, in seiner höchst reduzierten Form Ammonium, durch biologische Membranen. Alle Mitglieder dieser Proteinfamilie haben sehr konservierte Aminosäuren in potenziell funktionell wichtigen Positionen inne, die in Proteinkristallstrukturen gefunden wurden [1]–[6]. Der genaue Mechanismus des Ammoniumtransportes ist immer noch nicht vollständig aufgeklärt, obwohl sich einige Forschungsgruppen, seit deren Entdeckung, mit deren Erforschung befassen [7]–[10].
In einem in vitro Assay, der Festkörper-unterstützten Membran (SSM-basierende) Elektrophysiologie, in dem reines Protein von Archaeoglobus fulgidus Amt1 und Amt3 in Liposomen rekonstituiert wurde, konnte elektrogener Ammoniumtransport nachgewiesen werden [11]. Diese Arbeit wurde in drei große Themen aufgeteilt. (1) Das Histidin Zwillingspaar (H157 und H305), welches im hydrophoben Bereich des Transportkanals liegt. Für diese zwei Aminosäuren wurde postuliert das sie in einem De/Portionierungsprozess während des Substrattransportes eine wichtige Rolle spielen. (2) Die Rekrutierungsstelle und der Selektivitätsfilter (W137 und S208), welche beim Eingang des Transportkanals zu finden sind. (3) Sowie die Rolle des „Loop5“ und deren Wechselwirkung mit dem C-Terminus.
Um diese drei Themengebiete zu untersuchen, wurden verschiedene Einzel-, Doppel- und Deletionsvarianten von Af-Amt1 produziert, gereinigt, mit SSM-basierender Elektrophysiologie untersucht und Strukturen durch Röntgen-Proteinkristallografie gelöst. Des Weiteren wurden die Proteoliposomen durch Gefrierbruch Transmission Elektronen Mikroskopie abgebildet. Eine Methode, die während dieser Arbeit im Labor etabliert werden konnte.
Dadurch konnten verschiedene neue Erkenntnisse über den Transport gewonnen werden. (1) Die De-und Reprotonierung von Ammonium ist der bevorzugte Transportweg, wobei starke H-Brückenbildung den Verlust zu einem gewissen Teil kompensieren kann. Mutationen des Histidin Zwillingspaars verändern die Selektivität, Ammoniumaffinität und die pH-Abhängigkeit im Vergleich zum Wildtyp. Für zwei Af-Amt Varianten konnte Kaliumtransport nachgewiesen werden, sowie Inhibierungen der Varianten, im Gegensatz zum Wildtyp, durch Thallium. (2) Das diese Region nicht essenziell für den Ammoniumtransport ist. Varianten der zwei Aminosäuren ändern nur leicht die Selektivität, Ammoniumaffinität und die pH-Abhängigkeit im Vergleich zu den Varianten des Histidin Zwillingspaars. Der interessanteste Fund ist der gesteigerte Methylammoniumtransport der W137L, S208A und W137L/S208A Varianten im Vergleich zum Wildtyp. (3) Eine Kürzung von „Loop5“ beeinflusst den Ammoniumtransport, Ammoniumaffinität und die pH-Abhängigkeit nur gering. Eine Deletion von fünf Aminosäuren konnte als Schwelle gefunden werden, ab welcher der Transport vollständig verschwindet. Außerdem konnte eine essentielle Wechselwirkung zwischen dem Rest einer „Loop5“ Aminosäure, H185, und einer C-Terminus Aminosäure, Y390, gefunden werden. Varianten dieser zwei Aminosäuren reduzieren den Ammoniumtransport drastisch.
Zusammengefasst werden die Transporteigenschaften von Ammoniumtransportern von einem Zusammenspiel verschiedener Aminosäureresten und Positionen im Transportkanal definiert. Zudem ist es nicht möglich eine Rolle, den Untersuchten Positionen, unabhängig voneinander zuzuordnen

Object Details

• Location: Deutsche Nationalbibliothek Frankfurt am Main
• Extent: Online-Ressource
• Language: Englisch
• Notes: Universität Freiburg, Dissertation, 2018

Contributors, Places and Time

• Event: Veröffentlichung
• (where): Freiburg
• (who): Universität
• (when): 2018
• Creator: Frank, Fabian Klaus
• Contributor: Andrade, Susana ; Albert-Ludwigs-Universität Freiburg. Fakultät für Chemie und Pharmazie

Further information

• DOI: 10.6094/UNIFR/16986
• URN: urn:nbn:de:bsz:25-freidok-169862
• Rights: Der Zugriff auf das Objekt ist unbeschränkt möglich.
• Last update: 25.03.2025, 1:57 PM CET