Molecular analysis of chromatin remodeling activities by the T-box transcription factors

Abstract: The process of gastrulation results in the three-layered embryo and is characterized by a precise context- and time-specific regulation of transcriptional activity. The early expressed T-box transcription factor EOMES plays a crucial role by conducting the specification of mesoderm and endoderm and preventing the specification of neuroectodermal derivates. The exact molecular mechanisms of this first cell-lineage specification are still unknown. Latest findings indicate that the presence of EOMES at ME genes results in an open chromatin state while binding to already accessible NE enhancers has repressive effects. These changes in chromatin are in accordance to an association of EOMES with chromatin remodeling complexes found in mass spectrometry analysis. Particularly several components of the multi-subunit complexes BAF and NuRD emerged from a large spectrum of potential interaction partners. Mammalian BAF complex, member of the SWI/SNF family, is mainly considered to create an accessible chromatin state and allows active gene expression. In contrast, activity of the NuRD complex mostly results in a closed chromatin formation and transcriptional repression. Both ATP-dependent chromatin remodeling complexes have a wide cellular distribution and were shown to have indispensable roles in development by cooperating with tissue-specific co-regulators.
This project aimed to better characterize the T-box factor induced chromatin remodeling by identifying the interacting subunit(s) of BAF and NuRD complex. The experimental setting included transfection of HEK293T cells and P19CL6 cells, co-immunoprecipitation and analysis on Western Blot. As specific interactors of EOMES, BAF60B of the BAF complex and MBD3 of the NuRD complex were identified. The recruitment of chromatin remodeling complexes via unique subcomponents is a possible mechanism to specifically influence transcriptional activity on target genes. Hereby, the cooperation of EOMES and BAF complex would result in accessible chromatin at ME genes, while interaction with NuRD complex would prevent expression of NE and pluripotency genes.
Furthermore, the characteristic appearance of EOMES protein as three bands on Western blots was analyzed by mass spectrometry (MS). Additional bands are larger than the expected molecular weight of EOMES, thus I focused on post-translational modifications. A preliminary MS analysis revealed ubiquitination as possible modification. If ubiquitination has a functional impact on EOMES requires further studies.
In summary, this project gives further proof of direct interaction of EOMES and chromatin remodeling complexes BAF and NuRD and serves a model where chromatin remodeling importantly contributes to the specific functions of T-box factors. The detailed effects of this cooperation on transcriptional chromatin-based and T-box dependent regulation during the first cell lineage decision needs further investigation
Abstract: Die Gastrulation, die den drei-keimblättrigen Embryo hervorbringt, ist gekennzeichnet durch eine präzise kontext- und zeit-spezifische Regulation transkriptioneller Abläufe. Der frühzeitig exprimierte T-box-Transkriptionsfaktor EOMES veranlasst eine Spezifizierung embryonaler Zellen zu Mesoderm und Endoderm (ME), während zeitgleich die Spezifizierung hin zu neuroektodermalen (NE) Derivaten verhindert wird. Die genauen molekularen Mechanismen dieser ersten Zelllinien-Spezifizierung sind jedoch nicht bekannt. Aktuelle Erkenntnisse deuten darauf hin, dass die Präsenz von EOMES an mesoendodermalen Genen zu einer offenen Chromatinstruktur führt, während die Bindung von EOMES an bereits geöffneten neuroektodermalen Enhancern repressive Effekte hat. Diese Veränderung der Chromatinstruktur ist vereinbar mit einer Assoziation von EOMES und Chromatin-remodellierenden Komplexen, die bereits in massenspektrometrischen Analysen gezeigt wurde. Dabei konnten insbesondere mehrere Komponenten der BAF- und NuRD-Komplexe nachgewiesen werden, welche beide aus mehreren Untereinheiten bestehen. Als Teil der SWI/SNF-Komplex-Familie, generiert der BAF-Komplex in Säugetieren vor allem eine für Transkription zugängliche Chromatinstruktur, die aktive Genexpression erlaubt. Im Gegensatz dazu, führt die Aktivität des NuRD-Komplexes zu geschlossenem Chromatin und transkriptioneller Repression. Beide Komplexe arbeiten ATP-abhängig, sind in fast allen Zelltypen vorhanden und haben im Zusammenspiel mit gewebespezifischen Co-Regulatoren unabdingbare Funktionen während der embryonalen Entwicklung.
Das Ziel dieses Projekts war es, die T-box-Faktor vermittelte Remodellierung von Chromatin besser zu charakterisieren und die jeweils interagierenden Untereinheit(en) des BAF- und NuRD-Komplexes zu identifizieren. Dazu wurden Co-Transfektion von HEK293T und P19CL6 Zellen, Co-Immunopräzipitation und Western Blot Analysen durchgeführt. Als spezifische Interaktionspartner von EOMES wurden BAF60B als Untereinheit des BAF-Komplexes und MBD3 als Untereinheit des NuRD-Komplexes ermittelt. Die Rekrutierung von Chromatin-remodellierenden Komplexen mittels einzelner, spezifischer Untereinheiten gilt als möglicher Mechanismus, die Transkription von Zielgenen spezifisch zu regulieren. Ich schlage ein Modell vor, in dem die Kooperation von EOMES und dem BAF-Komplex das Chromatin der ME-Gene der Transkription zugänglich macht, während eine Interaktion mit dem NuRD-Komplex die Expression von NE- und Pluripotenzgenen verhindert.
Weiterhin wurden die charakteristischen drei EOMES-Protein-Banden, die sich üblicherweise auf Western Blots zeigen, mittels Massenspektrometrie (MS) auf mögliche posttranslationale Modifiaktionen analysiert. Eine erste orientierende MS Analyse zeigte die Ubiquitinierung von EOMES als mögliche Modifikation. Ob diese einen funktionellen Effekt auf EOMES hat, bleibt jedoch unklar und erfordert weitere Experimente

Object Details

• Location: Deutsche Nationalbibliothek Frankfurt am Main
• Extent: Online-Ressource
• Language: Englisch
• Notes: Universität Freiburg, Dissertation, 2022

Classification and Topics

• Keyword: Transkriptionsfaktor ; Embryonalentwicklung ; Chromatin ; Genregulation ; Genexpression ; Maus

Contributors, Places and Time

• Event: Veröffentlichung
• (where): Freiburg
• (who): Universität
• (when): 2022
• Creator: Mersiowsky, Sophie-Luise
• Contributor: Arnold, Sebastian Johannes ; Arnold, Sebastian Johannes ; Timmers, Hermanus T. ; Albert-Ludwigs-Universität Freiburg. Abteilung Pharmakologie II ; Albert-Ludwigs-Universität Freiburg. Medizinische Fakultät

Further information

• DOI: 10.6094/UNIFR/231788
• URN: urn:nbn:de:bsz:25-freidok-2317885
• Rights: Open Access; Der Zugriff auf das Objekt ist unbeschränkt möglich.
• Last update: 25.03.2025, 1:49 PM CET