Characterisation of family 2 polyphosphate kinases
Abstract: Polyphosphate kinases (PPK) are enzymes catalysing the reversible phosphorylation of nucleotides. PPK1 have initially been described to use nucleoside triphopshates (NTPs) such as adenosine triphosphate (ATP) to synthesise the long-chain-polymer polyphosphate (polyP) while PPK2 catalyse the reverse reaction. PPK2 are further classified based on phylogenetic analysis and their preferred substrate; PPK2-I phosphorylate nucleoside diphosphates, PPK2-II nucleoside monophosphates, and PPK2-III catalyse both phosphorylations.
In the first part of the presented thesis, the structure-function interaction of PPK2 enzymes was investigated. Four enzymes of the PPK2-II subclass were biochemically characterised. Two of the enzymes were crystallised and the structures solved; for one of the enzymes, additional substrate bound structures could be obtained. The structures were assigned to stages of catalysis and allowed to hypothesise a catalytic cycle.
In the second part, the thermodynamic characteristics of the ADP phosphorylation were investigated. To optimise conditions for the reaction, a proper knowledge of the thermodynamics of the reaction have to be at hand. Therefore, representative enzymes of PPK1 and PPK2-I were studied regarding their ability to synthesise ATP from ADP and vice versa. The observed thermodynamic equilibrium matched for all enzymes and Christoph Held from the TU Dortmund could qualitatively describe the reaction outcome using perturbation theory. To quantitatively apply such ePC-SAFT predictions, precisely described reactions with triphosphate and tetraphosphate were performed to generate data to adapt and improve future predictions of polyP containing reactions.
Lastly, different PPK2 enzymes were combined with a nucleoside kinase (NK) to convert various natural and unnatural nucleosides to the corresponding NTPs. The cascade efficiently converted adenosine analogues and the rate of conversions were comparable to the single enzyme reaction. When converting cytidine and its modifications however, mediocre conversion was observed. This sets future perspectives for advancing research to further connect structure and functionality of the enzymes
Abstract: Polyphosphatkinasen (PPK) sind Enzyme, die die reversible Phosphorylierung von Nukleotiden katalysieren. PPK1 wurden ursprünglich beschrieben als Enzyme, welche Nukleosidtriphosphate (NTPs), wie zum Beispiel Adenosintriphosphat (ATP), für die Synthese des langkettigen Polymers Polyphosphat (polyP) verwenden, wohingegen PPK2 die umgekehrte Reaktion katalysieren. PPK2 werden basierend auf einer phylogenetischen Analyse und des präferierten Substrates, weiter unterteilt; PPK2-I phosphorylieren Nukleosiddiphosphate, PPK2-II Nukleosidmonophosphate und PPK2-III katalysieren beide Phosphorylierungen.
Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurden die Struktur-Funktions Beziehungen von PPK2 Enzymen untersucht. Vier Enzyme der PPK2-II Unterklasse wurden biochemisch charakterisiert. Zwei der Enzyme konnten kristallisiert und deren Struktur gelöst werden, für eines konnten zusätzliche substratgebundene Strukturen erhalten werden. Diese Strukturen wurden Katalyseschritten zugeordnet und erlaubten einen Katalysezyklus vorherzusagen.
Im zweiten Teil wurden die thermodynamischen Charakteristika der Reaktion untersucht. Um die Bedingungen der Phosphorylierungsreaktion zu optimieren, bedarf es entsprechendem Wissen über die Thermodynamik der Reaktion. Hierfür wurden repräsentative Enzyme der PPK1 und PPK2-I verwendet und hinsichtlich ihrer Fähigkeit untersucht, ATP aus ADP zu synthetisieren und vice versa. Das beobachtete thermodynamische Gleichgewicht war identisch für alle Enzyme und konnte von Christoph Held mittels Störungstheorie qualitativ beschrieben werden. Um solche ePC-SAFT Vorhersagen auch quantitativ anzuwenden, wurden genau definierte Experimente mit Triphosphat und Tetraphosphat durchgeführt, um notwendige Daten zu erhalten und zukünftige Vorhersagen für polyP beinhaltende Reaktionen zu verbessern.
Schlussendlich wurden verschiedene PPK2 mit einer Nukleosidkinase (NK) kombiniert um diverse natürliche und unnatürliche Nukleoside in die entsprechenden NTPs zu konvertieren. Die Kaskade konnte effizient Adenosin und Adenosinderivate mit einer, zu der Einzel-Enzym-Reaktion vergleichbaren Effizienz, umsetzen. Bei der Umsetzung von Cytidin und dessen Analoga wurde jedoch eine eingeschränkte Umsetzung beobachtet. Das bildet die Grundlage für weitere Untersuchungen um Zusammenhänge von Struktur und Funktionalität der Enzyme zu verstehen
- Standort
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Deutsche Nationalbibliothek Frankfurt am Main
- Umfang
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Online-Ressource
- Sprache
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Englisch
- Anmerkungen
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Universität Freiburg, Dissertation, 2022
- Schlagwort
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Nucleotide
Enzymkatalyse
Chemische Synthese
Nucleinsäuren
- Ereignis
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Veröffentlichung
- (wo)
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Freiburg
- (wer)
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Universität
- (wann)
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2023
- Urheber
- DOI
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10.6094/UNIFR/233184
- URN
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urn:nbn:de:bsz:25-freidok-2331847
- Rechteinformation
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Open Access; Der Zugriff auf das Objekt ist unbeschränkt möglich.
- Letzte Aktualisierung
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25.03.2025, 13:51 MEZ
Datenpartner
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Beteiligte
Entstanden
- 2023