Substrates and methods for the characterisation of DNA and RNA modifying enzymes: application to TET oxygenases

Abstract: DNA und RNA Modifikationen, wie 5mC (5-Methylcytosin), 5hmC (5-Hydroxymethylcytosin) und m6A (6-Methyladenin), spielen eine essenzielle Rolle in der Regulation von Genexpression und anderen zellulären Prozessen. Enzyme, die diese Modifikationen einführen oder entfernen, sind Gegenstand aktueller Forschung und stellen vielversprechende Angriffspunkte für die Behandlung von Krebs oder neurodegenerativen Krankheiten dar. Die Familie der TET-Enzyme katalysiert die schrittweise Oxidation von 5mC über 5hmC zu weiteren Oxidationsprodukten (5fC (5-Formylcytosin) und 5caC (5-Carboxycytosin)) in DNA und RNA, was anschließend zur Demethylierung von der Nukleobase 5mC führt. TET-Enzyme sind, ebenso wie ALKBH5 und FTO, Fe(II) und 2OG (2-Oxoglutarat) abhängige Oxygenasen. Das Ziel dieses Projekts war es, zunächst mehrere Assays zur Charakterisierung der Aktivität dieser Oxygenasen zu etablieren. Hierbei wurden sowohl Assays, die den Verbrauch von 2OG quantifizieren,als auch Methoden, die auf dem direkten Nachweis der Reaktionsprodukte − modifizierte Nukleoside − basieren, entwickelt. Mehr als 1000 Substanzen wurden initial bezüglich ihrer inhibitorischen Effekte auf TET-Enzyme untersucht und aus den gewonnenen Ergebnissen wurde in Kombination mit in situ-Dockingstudien eine neuartige Leitstruktur für potentielle TET-Inhibitoren entwickelt. Im Zuge dieses Projekts wurde eine Syntheseroute für diese Struktur etabliert und darauf basierend mehrere Derivate synthetisiert und an TET-Enzymen getestet. Neben der Etablierung der bereits erwähnten in vitro-Assays, wurden im Zuge dieser Arbeit die zellulären Effekte von TET-Inhibitoren an embryonalen Stammzellen evaluiert und mit IOX1 ein vielversprechender TET-Inhibitor gefunden, der einen IC50-Wert von 30 μM in vitro aufweist und bei einer Konzentration von 25 μM die genomischen 5hmC-Level in cellulo um mehr als 60 % reduziert. Zusätzlich wurden verschiedene Nukleosidanaloga synthetisiert: Diese wurden zum einen zur Validierung der erwähnten Assays genutzt, zum anderen konnte auch eine enzymatische Triphosphorylierung von Ribonukleosidanaloga erreicht werden. Diese Nukleosidtriphosphat- Analoga wurden mittels in vitro-Transkription in mRNA eingebaut und eine erhöhte Stopcodon-Erkennung bei 5mC bzw. 5hmC erhaltender mRNA wurde gezeigt. Daneben wurde eine Syntheseroute zu fluorierten und 6-aza-modfizierten (2’-Desoxy)-Cytidin Analoga evaluiert. Hierbei wurden verschiedene, synthetische und enzymatische Ansätze verfolgt. Unter anderem wurde ein fluoriertes Methioninanalogon synthetisiert, um eine enzymatische Übertragung von Trifluormethylgruppen zu untersuchen

Object Details

• Location: Deutsche Nationalbibliothek Frankfurt am Main
• Extent: Online-Ressource
• Language: Englisch
• Notes: Universität Freiburg, Dissertation, 2021

Classification and Topics

• Keyword: RNS ; DNS ; Nucleinsäuren ; Oxygenasen ; Nucleoside ; Epigenetik ; Cytosin ; Nucleinsäurederivate

Contributors, Places and Time

• Event: Veröffentlichung
• (where): Freiburg
• (who): Universität
• (when): 2022
• Creator: Auth, Marina
• Contributor: Lönarz, Christoph ; Jung, Manfred ; Arnold, Sebastian Johannes ; Albert-Ludwigs-Universität Freiburg. Institut für Pharmazeutische Wissenschaften ; Albert-Ludwigs-Universität Freiburg. Fakultät für Chemie und Pharmazie

Further information

• DOI: 10.6094/UNIFR/223378
• URN: urn:nbn:de:bsz:25-freidok-2233781
• Rights: Open Access; Der Zugriff auf das Objekt ist unbeschränkt möglich.
• Last update: 14.08.2025, 11:02 AM CEST