Spectroelectrochemical studies of oxygen-tolerant membrane-bound [NiFe] hydrogenase on transparent conducting oxide thin films

Abstract: [NiFe] hydrogenases are a class of metalloenzymes that catalyze the reversible heterolytic splitting of molecular hydrogen (H2) into protons and electrons. While most hydrogenases are catalytically inhibited in the presence of oxygen, the [NiFe] hydrogenases from Ralstonia eutropha exhibit a remarkable tolerance to oxygen. Maintaining catalytic activity in aerobic conditions makes this enzyme suitable for incorporation into hydrogen-based energy storage and conversion devices. In order to exploit its catalytic properties in technological applications, it is crucial that the enzyme be successfully immobilized on conductive substrates, i.e. electrodes, which are specifically and purposefully designed to promote a desired enzyme-electrode interaction. This means controlling electrode surface parameters such as (but not necessarily limited to) its biocompatibility, the material’s conductivity, its surface charges, surface morphology (such as roughness), and how hydrophilic/phobic it is. These concepts are transferred into the general structural design of the electrode, including the electrode’s porosity and surface accessibility for large molecules. Understanding how these parameters collectively affect enzyme-electrode interaction and conversely the enzyme’s electrocatalytic output provides a blueprint on how to design and construct optimized hybrid bioelectrodes with high current densities.

Here, we use transparent conducting oxides (TCOs), specifically as thin films, to utilize for enzyme immobilization and enzyme-electrode study. TCOs have increasingly gained attention due to their combination of conductivity and optical transparency. As electrode materials for enzyme immobilization, TCOs are biocompatible platforms that are ideal for spectroelectrochemical analysis. Additionally, due to their optically transparent nature, TCOs make excellent substrates for bio-photoelectrodes.

In this work, aliquoted samples of membrane-bound [NiFe] hydrogenase from Ralstonia eutropha was received engineered with either one of two different tags: either a hexahistidinetag or a strep-tag. The tagged MBHs were immobilized onto three different TCO materials: indium tin oxide (ITO10 – tin-doped indium oxide with a 10:90 wt% SnO2:In2O3 ratio), tin-rich indium tin oxide (ITOTR - an amorphous yet conductive TCO with an In to Sn stoichiometry of one to one), and antimony doped tin oxide (ATO) to study as functional bioelectrodes. The contents of this dissertation can be split into three main objectives: the first is to study and understand the fundamental interactions between the differently tagged MBHs and the TCO surfaces. One aspect of this is to see whether the engineered tag has any influence on the interaction between the MBH and TCO surface and how can we optimize it so that the MBH is stably attached to the TCO surface in a favourable orientation. Secondly, this work seeks to understand how these interactions influence the electrocatalysis of the MBH and lastly, how can we use this information to exploit the unique electrocatalytic behaviour of the MBH/TCO hybrid electrode as a bioanode in a fuel cell.

To achieve these aims, electrochemical measurements of MBH-electrode assemblies were conducted to examine the changes in electrocatalytic behaviour (primarily focusing on hydrogen oxidation) of the immobilized enzyme as a function of the material, including changes in the type of electron transfer, current density and stability. A modified ATR-IR setup is used to examine (a) the in-situ adsorption and desorption processes and gain a better understanding of the enzyme-electrode interface, as well as (b) the catalytic mechanism by probing the [NiFe] active site of the enzyme on the three TCO substrate electrodes.

Finally, the knowledge of how the MBH interacts with the ATO surface is extended into high surface area electrodes for biotechnological (i.e. enzymatic fuel cell) applications. Here, graphitic carbon paper is used as a scaffolding to layer a thin-film (~ 20nm) of ATO. After optimizing electrode manufacturing conditions, high concentration densities of MBH was immobilized onto the surface ultimately demonstrating high bioanode current densities of over a mA/cm2
Abstract: [NiFe]-Hydrogenasen sind eine Klasse von Metalloenzymen, welche die reversible heterolytische Aufspaltung von molekularem Wasserstoff (H2) in Protonen und Elektronen katalysieren. Während die meisten Hydrogenasen in Gegenwart von Sauerstoff katalytisch gehemmt werden, weist die [NiFe]-Hydrogenase aus Ralstonia eutropha eine bemerkenswerte Toleranz gegenüber Sauerstoff auf. Durch die Aufrechterhaltung der katalytischen Aktivität unter aeroben Bedingungen eignet sich dieses Enzym für den Einbau in wasserstoffbasierte Energiespeicher und Energiewandler. Um seine katalytischen Eigenschaften in technologischen Anwendungen nutzen zu können, muss das Enzym jedoch erfolgreich auf geeigneten leitfähigen Substraten, d.h. Elektroden, immobilisiert werden, die speziell und zielgerichtet so gestaltet sind, dass sie eine gewünschte Enzym-Elektroden-Interaktion fördern. Dies bedeutet, dass die Parameter der Elektrodenoberfläche kontrolliert werden müssen, wie z. B. (aber nicht notwendigerweise beschränkt auf) ihre Biokompatibilität, die Leitfähigkeit des Materials, seine Oberflächenladungen, die Oberflächenmorphologie (wie z. B. die Rauheit) und die Hydrophilie/-phobie des Materials. Diese Konzepte werden in das allgemeine strukturelle Design der Elektrode übertragen, einschließlich der Porosität der Elektrode und der Zugänglichkeit der Oberfläche für große Moleküle. Wenn man versteht, wie sich diese Parameter auf die Interaktion zwischen Enzym und Elektrode und umgekehrt auf die elektrokatalytische Leistung des Enzyms auswirken, erhält man einen Plan, wie man optimierte hybride Bioelektroden mit hohen Stromdichten entwerfen und konstruieren kann.

Hier verwenden wir transparente leitende Oxide (TCOs), insbesondere als dünne Filme, um sie für die Immobilisierung von Enzymen und die Untersuchung von Enzym-Elektroden einzusetzen. TCOs haben aufgrund ihrer Kombination aus Leitfähigkeit und optischer Transparenz zunehmend an Aufmerksamkeit gewonnen. Als Elektrodenmaterialien für die Enzymimmobilisierung sind TCOs biokompatible Plattformen, die sich ideal für spektroelektrochemische Analysen eignen. Darüber hinaus eignen sich TCOs aufgrund ihrer optischen Transparenz hervorragend als Substrate für Bio-Photoelektroden.

Für diese Arbeit wurden aliquote Proben der membrangebundenen [NiFe]-Hydrogenase aus Ralstonia eutropha mit einem von zwei verschiedenen Tags beschafft: entweder mit einem Hexahistidin-Tag oder einem Strep-Tag. Die markierten MBHs wurden auf drei verschiedenen TCO-Materialien immobilisiert: Indiumzinnoxid (ITO10 - zinndotiertes Indiumoxid mit einem Verhältnis von 10:90 Gew.-% SnO2:In2O3), zinnreiches Indiumzinnoxid (ITOTR - ein amorphes, aber leitfähiges TCO mit einer Stöchiometrie von In zu Sn von eins zu eins) und antimondotiertes Zinnoxid (ATO), um sie als funktionelle Bioelektroden zu untersuchen.

Der Inhalt dieser Arbeit lässt sich in drei Hauptziele unterteilen: Das erste ist die Untersuchung und das Verständnis der grundlegenden Wechselwirkungen zwischen den unterschiedlich markierten MBHs und den TCO-Oberflächen. Dabei geht es unter anderem darum, herauszufinden, ob der technisch hergestellte Tag einen Einfluss auf die Wechselwirkung zwischen MBH und TCO-Oberfläche hat und wie wir ihn so optimieren können, dass die MBH in einer günstigen Ausrichtung stabil an die TCO-Oberfläche gebunden ist. Zweitens soll in dieser Arbeit verstanden werden, wie diese Wechselwirkungen die Elektrokatalyse der MBH beeinflussen und schließlich, wie wir diese Informationen nutzen können, um das einzigartige elektrokatalytische Verhalten der MBH/TCO-Hybridelektroden als Bioanoden in Brennstoffzellen zu nutzen.

Um diese Ziele zu erreichen, wurden elektrochemische Messungen an MBH-Elektroden-Einheiten durchgeführt, um die Veränderungen im elektrokatalytischen Verhalten des immobilisierten Enzyms in Abhängigkeit vom Material zu untersuchen, einschließlich Veränderungen in der Art des Elektronentransfers, der Stromdichte und der Stabilität. Ein modifizierter ATR-IR-Aufbau wurde verwendet, um (a) die In-situ-Adsorptions- und Desorptionsprozesse zu untersuchen und ein besseres Verständnis der Enzym-Elektroden-Grenzfläche zu erlangen sowie (b) den katalytischen Mechanismus durch Untersuchung des [NiFe]-Aktivzentrums des Enzyms auf den drei TCO-Substratelektroden zu untersuchen.

Schließlich wird das Wissen darüber, wie die MBH mit der ATO-Oberfläche interagiert, auf Elektroden mit großer Oberfläche für biotechnologische Anwendungen (z. B. enzymatische Brennstoffzellen) ausgeweitet. Hierbei wird graphitisches Kohlenstoffpapier als Basis verwendet, um einen dünnen Film (~ 20 nm) aus ATO aufzubringen. Nach der Optimierung der Elektrodenherstellungsbedingungen wurden hohe Konzentrationsdichten von MBH auf der Oberfläche immobilisiert, was schließlich zu hohen Wasserstoffoxidations-Stromdichten von über 1 mA/cm2 führt

Angaben zum Objekt

• Standort: Deutsche Nationalbibliothek Frankfurt am Main
• Umfang: Online-Ressource
• Sprache: Englisch
• Anmerkungen: Universität Freiburg, Dissertation, 2021

Klassifikation und Themen

• Schlagwort: Hydrogenasen ; Transparent-leitendes Oxid ; Spektroelektrochemie ; Infrarotspektroskopie ; Elektrochemie

Beteiligte, Orts- und Zeitangaben

• Ereignis: Veröffentlichung
• (wo): Freiburg
• (wer): Universität
• (wann): 2022
• Urheber: Davis, Victoria
• Beteiligte Personen und Organisationen: Fischer, Anna ; Kurz, Philipp ; Zebger, Ingo ; Institut für Anorganische und Analytische Chemie. Freiburg im Breisgau ; Albert-Ludwigs-Universität Freiburg. Fakultät für Chemie und Pharmazie ; Professur für Bioanorganische Chemie

Weitere Informationen

• DOI: 10.6094/UNIFR/229481
• URN: urn:nbn:de:bsz:25-freidok-2294819
• Rechteinformation: Open Access; Der Zugriff auf das Objekt ist unbeschränkt möglich.
• Letzte Aktualisierung: 14.08.2025, 10:55 MESZ