Biophysical interactions of peptides and their analogues with lipid membranes: applications in drug development and drug delivery

Abstract: Many drugs, displaying a wide range of structures and diverse applications, can cross or bind to lipid membranes. Quantitative understanding of membrane interactions is thus important for several therapeutic approaches. First, membrane permeabilization represents the dominating mode of action of antimicrobial peptides (AMPs) and their synthetic mimics (SMAMPs). In terms of clinical applications, selectivity for bacterial over mammalian membranes is as important as good activity. Second, membrane interactions might influence loading, retaining, and releasing drugs from lipid-based drug delivery systems in a time controlled and targeted manner. Understanding the binding behaviour of the peptide drug exenatide to lipid membranes is not only important for characterization of its release from vesicular phospholipid gels, but might also help to understand other complex peptide-lipid interactions. The main aim of this thesis was to derive a mechanistic understanding of interactions of peptides and their analogues with model lipid membranes with a focus on the lipid composition of a membrane.
Membrane permeabilization induced by AMPs and SMAMPs was quantified by a lifetime-based leakage assay using calcein-loaded vesicles. Different leakage behaviours were identified by considering active concentrations, strengths of individual leakage events, L1, and cumulative kinetics. Further experiments using isothermal titration calorimetry (ITC), monolayer adsorption measurements, and differential scanning calorimetry (DSC) helped to characterize the initial binding of AMPs and SMAMPs to lipid membranes and their propensity to induce electrostatic lipid clustering.
Leakage experiments showed that the leakage behaviour changes with both, the structure of the AMP or SMAMP and the lipid composition of the membrane. The activity seems to increase if a membrane-active agent favours a permeabilization mechanism to which the particular lipid composition is especially susceptible. A closer look at kinetic profiles allowed distinguishing leakage induced by asymmetric stress from leakage events that occur stochastically. Very hydrophobic and unselective compounds seem to act mainly by hydrophobically driven asymmetry stress, especially when acting on zwitterionic phosphatidylcholine (PC) membranes. This mechanism brings about poor selectivity because all lipid membranes (bacterial and mammalian) contain a hydrophobic core. Stochastic leakage events, on the other hand, probably depend more on lipid compositions. Negatively charged lipids like phosphatidylglycerol (PG) or cardiolipin (CL) triggered the initial electrostatic attraction of polycationic AMPs or SMAMPs to bacterial membranes. High amounts of phosphatidylethanolamine (PE) seem to counteract the unselective asymmetry stress mechanism. Finally, especially strong leakage events were induced in vesicles containing CL. In this way, compounds that induce only rare leakage events might still be effective.
In the second part of the thesis, an ITC fit model was introduced to study complex peptide-lipid interactions based on primary binding of peptide to the lipid layer and secondary binding to pre-bound peptide. Exenatide served as an exemplary peptide that interacts electrostatically with mixed POPC/POPG liposomes and self-associates at Kd = 46 µM. A global fit of various ITC curves revealed that exenatide binds primarily to a binding site at the outer membrane leaflet composed of 2–3 negatively charged POPG and some POPC molecules. Primary binding showed high affinity with a Kd1 of 0.2–0.6 µM, while secondary binding with a Kd2 of 10–46 µM was weaker. ITC was able to quantify primary and secondary binding separately, based on different binding enthalpies. Unlike ITC, other methods such as tryptophan fluorescence and microscale thermophoresis (MST) probably represent only a summary or average of both effects. Many similar ITC data can be found in literature that possibly involve primary and secondary binding effects. Those data could benefit from a fit model as presented in this thesis
Abstract: Viele Arzneistoffe unterschiedlichster Strukturen und Anwendungsgebiete können an Lipidmembranen binden oder diese überwinden. Ein quantitatives Verständnis von Membraninteraktionen ist somit für viele therapeutische Ansätze von Bedeutung. Zum Beispiel beruht der hauptsächliche Wirkungsmechanismus antimikrobieller Peptide (AMPs) und deren synthetischer Mimetika (SMAMPs) auf der Permeabilisierung von Membranen. Für die klinische Anwendung ist ihre Selektivität für Bakterienmembranen im Vergleich zu körpereigenen Membranen genauso wichtig wie eine gute Aktivität. Im Falle lipid-basierter Drug Delivery-Systeme können Membraninteraktionen die Beladung, sowie die zeitkontrollierte und zielgerichtete Freisetzung von Arzneistoffen beeinflussen. Die Kenntnis über das Bindungsverhalten des Peptid-Arzneistoffs Exenatid an Lipidmembranen ist nicht nur wichtig, um seine Freisetzung aus vesikulären Phospholipidgelen zu charakterisieren. Sie kann auch dabei helfen, andere komplexe Peptid-Lipid-Interaktionen zu verstehen. Das Hauptziel dieser Arbeit bestand darin, ein besseres Verständnis der Interaktionen von Peptiden und deren Mimetika mit Model-Lipidmembranen zu generieren.
Die Membranpermeabilisierung durch AMPs und SMAMPs wurde mittels zeitaufgelöster Fluoreszenz durch Leakage-Experimente mit Calcein-gefüllten Liposomen quantifiziert. Verschiedene Permeabilitätsmechanismen wurden unter Berücksichtigung der aktiven Konzentrationen, Stärke individueller Leakage-Ereignisse, L1, und kumulativen Kinetiken identifiziert. Weitere Methoden wie isotherme Titrationskalorimetrie (ITC), Adsorptionsmessungen an Lipid-Monoschichten und Differential-Thermoanalyse (DSC) dienten der Charakterisierung der initialen Membranbindung der AMPs und SMAMPs, sowie der Identifizierung von Tendenzen für elektrostatisches Lipid-Clustering.
Die Leakage-Experimente zeigten, dass der Permeabilitätsmechanismus sowohl von der Struktur des AMPs oder SMAMPs als auch von der Lipidzusammensetzung der Membran abhängt. Die Aktivität scheint erhöht zu sein, wenn ein membran-aktiver Stoff einen Permeabilitätsmechanismus bevorzugt für den die jeweilige Lipidzusammensetzung besonders anfällig ist. Eine nähere Betrachtung von Leakage-Kinetiken erlaubte die Unterscheidung in Permeabilisierung, die durch Asymmetrie-Stress ausgelöst wird, und stochastisch auftretende Leakage-Ereignisse. Sehr hydrophobe und unselektive Stoffe scheinen hauptsächlich durch hydrophobe Wechselwirkungen und darauffolgenden Asymmetrie-Stress zu agieren, insbesondere an Membranen, die aus zwitterionischen Phosphatidylcholin (PC) bestehen. Dieser Mechanismus bringt wenig Selektivität mit sich, da alle Lipidmembranen (bakterielle und körpereigene) einen hydrophoben Kern haben. Im Gegensatz dazu hängen stochastisch auftretende Leakage-Ereignisse vermutlich stärker von der jeweiligen Lipidzusammensetzung ab. Negativ geladene Lipide wie Phosphatidylglycerol (PG) oder Cardiolipin (CL) begünstigten die initiale elektrostatische Anziehung zwischen den polykationischen AMPs oder SMAMPs und der Bakterienmembran. Hohe Anteile an Phosphatidylethanolamin (PE) schienen dem unselektiven Asymmetrie-Stress-Mechanismus entgegenzuwirken. Besonders starke Leakage-Ereignisse wurden in Liposomen beobachtet, die CL enthielten. So können auch Stoffe, die nur wenige Leakage-Ereignisse erzeugen, effektive Wirksamkeit zeigen.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde ein Fit-Modell für komplexe ITC-Daten eingeführt. Dieses erlaubt die Quantifizierung von Peptid-Lipid-Interaktionen, die auf einer primären Peptid-Bindung an Lipidschichten und einer sekundären Peptid-Bindung an bereits gebundene Peptide beruhen. Exenatid diente als exemplarisches Peptid, welches elektrostatisch mit gemischten POPC/POPG-Liposomen interagiert und mit einer Dissoziationskonstante, Kd, von 46 µM mit sich selbst assoziiert. Ein globaler Fit verschiedener ITC-Kurven zeigte, dass Exenatid primär an eine Bindungsstelle der äußeren Lipidschicht bindet, die aus 2–3 negativ geladenen POPG und einigen POPC-Molekülen besteht. Diese Primärbindung zeigte eine hohe Affinität mit einem Kd1-Wert von 0.2–0.6 µM, während die Sekundärbindung mit einen Kd2-Wert von 10–46 µM deutlich schwächer war. Mithilfe von ITC war es möglich, primäre und sekundäre Bindung aufgrund der verschiedenen Bindungsenthalpien getrennt zu quantifizieren. Im Gegensatz zu ITC, stellen andere Methoden wie Tryptophan-Fluoreszenz und Microscale Thermophorese (MST) nur eine Zusammenfassung oder einen Mittelwert beider Effekte dar. In der Literatur finden sich viele ähnliche ITC-Kurven, die möglicherweise auf primäre und sekundäre Bindungseffekte hinweisen und von dem hier dargestellten Fit-Model profitieren könnten

Object Details

• Location: Deutsche Nationalbibliothek Frankfurt am Main
• Extent: Online-Ressource
• Language: Englisch
• Notes: Universität Freiburg, Dissertation, 2019

Classification and Topics

• Keyword: Calorimetry ; Lipid membranes ; Peptides ; Drug development ; Liposom ; Antimikrobieller Wirkstoff ; Calcein ; Fluoreszenzspektroskopie ; Differential scanning calorimetry

Contributors, Places and Time

• Event: Veröffentlichung
• (where): Freiburg
• (who): Universität
• (when): 2019
• Creator: Stulz, Anja
• Contributor: Heerklotz, Heiko ; Albert-Ludwigs-Universität Freiburg. Fakultät für Chemie und Pharmazie

Further information

• DOI: 10.6094/UNIFR/151565
• URN: urn:nbn:de:bsz:25-freidok-1515652
• Rights: Der Zugriff auf das Objekt ist unbeschränkt möglich.
• Last update: 25.03.2025, 1:45 PM CET