NMR and photo-CIDNP studies on blue-light photoreceptor proteins and model systems

Abstract: Die hier vorgestellten Studien erforschen die lichtinduzierten Radikalpaarreaktionen flavin-basierter photoaktiver Proteine und geeigneter Modellsysteme mittels Kernmagnetresonanz-Methoden (NMR). Durch die Kopplung photochemischer Anregung mit NMR-Spektroskopie lassen sich auf Basis des Photo-CIDNP-Effektes (chemically induced dynamic polarization) hyperpolarisierte Kernspinzustände erzeugen. Anhand der beobachteten Hyperpolarisationsmuster können sowohl Rückschlüsse auf die zugrundeliegenden Reaktionsmechanismen gezogen als auch kurzlebige radikalische Zwischenstufen charakterisiert werden.

Zunächst wurden Flavinmononukleotid-Radikale (FMN) in isotroper wässriger Lösung hinsichtlich ihrer 1H- und 13C-Hyperfeinkopplungskonstanten charakterisiert (Kapitel 5). Im Falle der Protonen wurden alle relevanten Hyperfeinkopplungen absolut quantifiziert. Darüber hinaus wurden die relativen isotropen Hyperfeinkopplungen für alle Kohlenstoffpositionen des Isoalloxazinrings mithilfe universell und spezifisch isotopenmarkierter Flavinderivate bestimmt. Anhand dieser Ergebnisse war es erstmals möglich, die Spindichteverteilung in FMN-Radikalen unterschiedlicher Protonierungsstufen auf Basis einer experimentell bestimmten elektronischen Struktur des Kohlenstoffgerüstes zu diskutieren.

Chemisch modifizierte FMN-Derivate und ihre Photoreaktion mit L-Tryptophan wurden mittels optischer und zeitaufgelöster CIDNP-Spektroskopie untersucht (Kapitel 6). Bereits kleinste strukturelle Veränderungen, beispielsweise in Form von Demethylierung des aromatischen Systems, wirkten sich signifikant auf die photophysikalischen Eigenschaften des Chromophors sowie die elektronische Struktur der jeweiligen Semichinonradikale aus. Insgesamt wurden elf verschiedene demethylierte bzw. halogenierte FMN-Analoga erfolgreich charakterisiert.

FMN und L-Tryptophan in isotroper Lösung können als Modellsystem für Elektronentransferreaktionen in cystein-freien LOV-Domänen (light-oxygen-voltage) angesehen werden. Diese gehören zu einer der beiden bekannten CIDNP-aktiven Proteinklassen. Die Redoxaktivität von rekonstituierten LOV2-C450A-Mutanten mit artifiziellen FMN-Kofaktoren wurde mittels 13C-CIDNP-Spektroskopie nachgewiesen (Kapitel 7). Zusätzlich wurde der Aufbau der CIDNP-Polarisation auf der Mikrosekunden-Zeitskala in zeitaufgelösten CIDNP-Messungen verfolgt. Anhand der bestimmten Geschwindigkeitskonstanten konnte ein Reaktionschema für den Photozyklus der untersuchten Avena sativa LOV2-C450A-Mutante aufgestellt werden.

Schließlich wurde ein Versuchsaufbau für CIDNP-Experimente unter Festkörper- und MAS-Bedingungen (magic angle spinning) konzipiert (Kapitel 8). Dieser Ansatz ermöglicht weiterführende Experimente an anderen potentiell CIDNP-aktiven Proteinklassen sowie bei tiefen Temperaturen und in gefrorener Matrix. Erste Festkörper-CIDNP Experimente an LOV2-C450A-Mutanten zeigten, verglichen mit dem Verhalten in Lösung, einen unerwarteten Vorzeichenwechsel des gesamten Hyperpolarisationsmusters
Abstract: The studies presented in this thesis explore the light-induced radical pair reactions of flavin chromophores within photoactive proteins and model systems thereof by employing nuclear magnetic resonance (NMR) techniques. Hyperpolarized nuclear spin states can be generated via photochemically induced dynamic nuclear polarization (photo-CIDNP) on the basis of the interaction between unpaired electron spins and magnetic nuclei in their proximity. The information contained in time-resolved photo-CIDNP spectra allows for both the elucidation of reaction mechanisms of radical pair reactions and the characterization of the involved transient radicals.

The neutral and anionic radicals of flavin mononucleotide (FMN) were characterized in bulk aqueous solution regarding their 1H and 13C hyperfine coupling patterns (Chapter 5). Absolute values for all isotropic hyperfine coupling constants could be determined for the protons in proximity of the isoalloxazine ring. In addition, a complete carbon hyperfine map was established by employing universally 13C-labelled FMN and selectively labelled isotopologues. It enables, for the first time, a discussion of the spin density distribution in FMN radicals on the basis of experimental evidence that covers the electronic structure of the carbon framework.

Chemically modified FMN analogues and their photo-induced electron transfer reactions with L-tryptophan (Trp) were investigated by optical spectroscopy and time-resolved photo-CIDNP (Chapter 6). Even minor structural alterations such as demethylation showed a substantial influence on the photophysical properties of the chromophore as well as on the spin density distribution within the respective semiquinone radicals. In total, eleven different FMN analogues, including fluorinated and brominated derivatives, were successfully characterized.

The FMN/Trp system represents a model for the intra-protein electron transfer reaction that occurs in cysteine-devoid light-oxygen-voltage (LOV) domains, which constitute one of the two protein classes known to show an intra-protein photo-CIDNP effect. The redox activity of LOV2-C450A mutants, reconstituted with chemically modified cofactors, was demonstrated via 13C-photo-CIDNP spectroscopy (Chapter 7). Moreover, CIDNP build-up kinetics on a microsecond timescale were probed by time-resolved 13C-CIDNP on isotope-labelled LOV2 domains loaded with the native chromophore FMN. On the basis of these results, a reaction scheme is proposed for the photocycle of the investigated Avena sativa LOV2-C450A mutant.

Finally, the available in-situ illumination setup for solution-state NMR was extended to a solid-state photo-CIDNP experiment, including the necessary hardware modifications (Chapter 8). This opens up the means to investigate a wider range of light-sensitive proteins that, while eligible to show a CIDNP effect, exhibit properties unfavourable for investigation in the liquid state. First benchmark experiments under magic angle spinning (MAS) conditions revealed an unexpected sign change of the hyperpolarization pattern observed in LOV2-C450A, as compared to the liquid state

Angaben zum Objekt

• Standort: Deutsche Nationalbibliothek Frankfurt am Main
• Umfang: Online-Ressource
• Sprache: Englisch
• Anmerkungen: Universität Freiburg, Dissertation, 2020

Klassifikation und Themen

• Schlagwort: Flavine ; NMR-Spektroskopie ; CIDNP ; Flavoenzym ; Elektronentransfer ; MAS-NMR-Spektroskopie

Beteiligte, Orts- und Zeitangaben

• Ereignis: Veröffentlichung
• (wo): Freiburg
• (wer): Universität
• (wann): 2020
• Urheber: Pompe, Nils
• Beteiligte Personen und Organisationen: Weber, Stefan ; Albert-Ludwigs-Universität Freiburg. Fakultät für Chemie und Pharmazie

Weitere Informationen

• DOI: 10.6094/UNIFR/174541
• URN: urn:nbn:de:bsz:25-freidok-1745412
• Rechteinformation: Kein Open Access; Der Zugriff auf das Objekt ist unbeschränkt möglich.
• Letzte Aktualisierung: 25.03.2025, 13:47 MEZ