Magnetische Resonanz und optische Spektroskopie photochemisch erzeugter 5-Deazaflavin-Radikale

Abstract: Die Eigenschaften von Proteinen leiten sich hauptsächlich von ihren Kofaktoren und deren Wechselwirkung mit ihrer Umgebung ab. Daher sind sowohl Untersuchungen an isolierten als auch an in Proteinen eingebetteten Kofaktoren für das Verständnis von Proteinfunktionen von großem Interesse. In dieser Arbeit wurde die LOV-Domäne, eine weit verbreitete Untergruppe der PAS-Domänen (Per/Arnt/SIM), mit ihrem nativen Kofaktor FMN mit einer Variante, die 5-DeazaFMN als Kofaktor trägt, verglichen. Dabei kamen insbesondere Methoden der Kernspinresonanz (NMR) zum Einsatz. Ein Schwerpunkt lag dabei auf CIDNP-Experimenten (chemically induced dynamic nuclear polarization), mit denen Radikale, Radikalpaare und deren Folgeprodukte mit atomarer Auflösung untersucht werden können. Grundlage hierfür ist, dass elektronische Spindichten von (kurzlebigen) Radikalen auf langsam relaxierende Kernspins übertragen werden können.

Anhand des CIDNP-Effekts konnte im Rahmen dieser Arbeit erstmals zweifelsfrei ein 5-DeazaFMN-Radikal in wässriger Lösung nachgewiesen sowie seine relativen 1H-Hyperfeinkopplungskonstanten bestimmt werden. Darüber hinaus wurden Avena-sativa-LOV2-Domänen mit dem nativen Kofaktor FMN und mit 5-DeazaFMN miteinander verglichen. Der Wildtyp des Proteins bildet unter Belichtung ein kovalentes Addukt zwischen dem Kofaktor und dem Thiolrest eines benachbarten Cysteins. Für das FMN ist dabei die Bindungsstelle bekannt: C4a. In dieser Arbeit konnte mit NMR-Messungen gezeigt werden, dass die LOV2-Domäne mit 5-DeazaFMN als Kofaktor an ebendieser Stelle ein Addukt bildet.

In der LOV2-C450A-Mutante, in der das reaktive Cystein gegen ein unter physiologischen Bedingungen nicht-reaktives Alanin ausgetauscht wurde, bildet sich unter Lichteinstrahlung hingegen ein stabiles Radikalpaar aus, bestehend aus dem Kofaktor und einem weiter entfernten Tryptophan. Erstaunlicherweise scheint sich die Multiplizität des Radikalpaars abhängig vom Kofaktor von einem Triplett (im LOV2-C450A mit FMN) zu einem Singulett (im LOV2-C450A mit 5-DeazaFMN) zu ändern. Dies zeigt sich besonders deutlich bei niedrigen Magnetfeldern. Mit zunehmender Magnetfeldstärke zeigt die Mutante mit gebundenem 5-DeazaFMN wiederum ein abweichendes Verhalten im Vergleich zum Protein mit FMN: Während das Protein mit dem nativen FMN bei allen gemessenen Feldstärken einen einheitlichen Polarisationsmechanismus zeigt, scheint sich der dominante Polarisationsmechanismus beim 5-DeazaFMN mit ansteigender Magnetfeldstärke zu ändern
Abstract: The properties of proteins are largely determined by their respective cofactor and its interactions with the amino acids surrounding it. Therefore, investigations on isolated cofactors as well as cofactors incorporated into proteins are crucial for the understanding of protein functions. In this work LOV domains as a wide spread subgroup of the PAS (Per/Arnt/Sim) domain with their natural cofactor FMN were compared to a variant with 5-deazaFMN as an artifical cofactor. The mainly used method was nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy with a particular focus on CIDNP (chemically induced dynamic nuclear polarization) experiments that allow to investigate radicals, radical pairs and their reaction products on an atomic scale. This is possible as the electronic spin density of (short lived) radicals can be transferred to slowly relaxing nuclei by the CIDNP effect.

By using the CIDNP effect a 5-deazaFMN radical in aqueous solution could be detected for the first time by NMR spectroscopy and in addition to this, the hyperfine coupling constants of its protons could be determined. Furthermore, Avena sativa LOV2 domains with its natural cofactor FMN were compared to LOV2 domains with 5-deazaFMN. The wild type of the protein forms a covalent adduct between the cofactor and a nearby cysteine upon illumination. In the case of the cofactor FMN, the binding site is well-known: it is the C4a atom of the FMN. In this work it could be shown that LOV2 domains with 5-deazaFMN form the adduct via the same atom.

In LOV2 C450A mutants where the reactive cysteine was replaced by an (under physiological conditions) non-reactive alanine a stable radical pair consisting of the cofactor and a more distant tryptophan is formed upon illumination. Surprisingly, the multiplicity of the initial radical pair seems to depend on the cofactor and changes from a triplet (LOV2 C450A mutants with FMN) to a singlet (LOV2 C450A mutants with 5-deazaFMN). This effect is most prominent at low magnetic fields. With increasing field strengths the behaviour of the LOV2 C450A mutants with 5-deazaFMN differs again from LOV2 C450A mutants with FMN: Whereas the protein with the native FMN shows for all measured magnetic fields an uniform polarization mechanism, the dominant polarization mechanism seems to change for 5-deazaFMN with increasing magnetic fields strengths

Angaben zum Objekt

• Standort: Deutsche Nationalbibliothek Frankfurt am Main
• Umfang: Online-Ressource
• Sprache: Deutsch
• Anmerkungen: Universität Freiburg, Dissertation, 2020

Klassifikation und Themen

• Schlagwort: CIDNP ; NMR-Spektroskopie

Beteiligte, Orts- und Zeitangaben

• Ereignis: Veröffentlichung
• (wo): Freiburg
• (wer): Universität
• (wann): 2020
• Urheber: Wörner, Jakob
• Beteiligte Personen und Organisationen: Weber, Stefan ; Bacher, Adelbert ; Albert-Ludwigs-Universität Freiburg. Fakultät für Chemie und Pharmazie

Weitere Informationen

• DOI: 10.6094/UNIFR/165864
• URN: urn:nbn:de:bsz:25-freidok-1658643
• Rechteinformation: Open Access; Der Zugriff auf das Objekt ist unbeschränkt möglich.
• Letzte Aktualisierung: 25.03.2025, 13:50 MEZ