Budding as mechanism for the release of asymmetry stress in lipid membranes

Abstract: The plasma membrane separates the interior of a cell from the exterior. This lipid bilayer is involved in a multitude of processes: Transport occurs in small membrane vesicles. Some symbiotic organisms remodel their membranes in concert. Certain bacteria abuse the plasma membrane of their host as vector for entry. Even some viruses – HIV among them – appropriate their hosts’ plasma membrane for their own purposes.

Common to all these processes is active reshaping of the membrane. This is done by influencing the local membrane curvature through a variety of (complementary) mechanisms. One such mechanism is the overcrowding of one of the two layers through unidirectional translocation of lipid molecules. The result of this overcrowding is a mismatch in surface area requirements of the inner and outer layer: Asymmetry stress. The flexible lipid bilayer will then minimize stress by adjusting its shape: High local curvature satisfies area requirements for both layers. If this proceeds to completion, a new vesicle of smaller radius will form by scission from the original lipid bilayer: A so-called Bud.

Despite wide interest in biological budding, little attention has been paid to the fundamental role of the lipid bilayer. Elucidating factors and processes involved in the modulation of curvature by overcrowding is a crucial step towards a better understanding of how cells control the shape of their plasma membrane.

A model system known to exhibit budding was therefore investigated. Liposomes composed of 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) were used as membrane mimetic. They were treated with lysophosphatidylcholine (lysoPC), a surfactant known to insert into the outer layer only, causing asymmetry stress.

The first aim of this work was to develop methods for the separation and subsequent characterization of Buds and Mother Vesicles (MVs). For particle-size based separation, Asymmetric Flow Field-Flow Fractionation (AF4) was selected due to its low interaction with sample. However, dilution inherent to separation by AF4 resulted in the extraction of lysoPC from Buds. This in turn caused refusion of a portion of the Buds. To quantify the fraction of Buds and MVs, a fluorescence probe was used: 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (NBD-DSPE) proved suitable. Because refusion of Buds prevented baseline-separation of fluorescence signals, a method for the arithmetical deconstruction of the contributions of Buds and MVs was developed. The size of particles was determined through use of the coated sphere model of Multiangle Laser Light Scattering (MALS). The lipid composition of Buds and MVs was assessed by high performance liquid chromatography (HPLC) from fractions separated by AF4.

The second aim of this work was to then characterize budding of the system POPC-lysoPC. It was found that the fraction of Buds increased only up to a certain molar ratio of lysoPC to POPC. The “osmotic barrier” theory was formulated as explanation: A priori nonspherical liposomes may only bud until they have become spherical – further budding will result in the buildup of an opposing osmotic gradient. As predicted by this theory, initially “less-spherical” liposomes were found to produce greater fractions of Buds. Calcein leakage experiments suggested that no leakage occurred during the formation and scission of a Bud or afterwards for MVs. Further, the internal osmotic concentration of MVs had increased, indicating that budding does indeed result in the buildup of an osmotic gradient of noticeable magnitude. With regard to the stability of Buds it was found that they are likely leaky and unstable at first: MALS results suggested that within minutes of their formation, they began fusing in a ratio of two to one; thereafter their size remained constant. Calcein-leakage assay suggested that Buds continue leaking for hours after their formation.

Finally, a model was formulated from geometric considerations: The previous findings suggested that dividing conserved internal volume and surface area between a single MV of variable radius and multiple Buds of fixed size allows predicting the fraction of Buds for liposomes of varied a priori “sphericity”. It was found that predicted values match closely with experimentally obtained results
Abstract: Die Plasmamembran trennt das Innere der Zelle von ihrem Äußeren. Diese Lipiddoppelschicht ist in einer Vielzahl von Prozessen involviert: Transport findet in kleinen Membranvesikeln statt. Einige in Symbiose lebende Organismen gestalten konzertiert ihre Membran um. Gewisse Bakterien missbrauchen die Plasmamembran ihres Wirtes als Angriffsvektor. Sogar einige Viren – darunter HIV – entfremden die Plasmamembran ihrer Wirtszelle für ihre eigenen Zwecke.

Gemeinsam ist all diesen Prozessen, dass die Membran aktiv umgeformt wird. Dies geschieht, indem die lokale Kurvatur der Membran durch eine Vielzahl (komplementärer) Mechanismen beeinflusst wird. Einer dieser Mechanismen ist das Überbestücken einer der beiden Schichten durch die einseitige Translokation von Lipidmolekülen. Das Resultat dieser Überbestückung ist eine ungleiche Oberflächenanforderung der inneren und der äußeren Schicht. Die flexible Lipiddoppelschicht wird dann zur Minimierung dieser Spannung ihre Form anpassen: Eine hohe
lokale Kurvatur ist in der Lage die Oberflächenanforderungen beider Schichten zu erfüllen. Sollte dieser Prozess sich zur äußersten Konsequenz vollziehen, so bildet sich ein neues Vesikel mit kleinerem Radius durch Abtrennung von der ursprünglichen Lipiddoppelschicht: Eine sogenannte Knospe.
Obwohl weitreichendes Interesse an biologischer Knospung besteht, wurde die fundamentale Rolle der Lipiddoppelschicht bisher nicht ausgiebig untersucht. Die Untersuchung der Faktoren und
Prozesse, die in der Veränderung der Kurvatur durch Überbestückung involviert sind, stellt einen entscheidenden Schritt dar, um zu verstehen, wie Zellen die Form ihrer Plasmamembran kontrollieren.

Aus diesem Grund, wurde ein Modellsystem, bei dem bekannt ist, dass Knospung stattfindet, untersucht. Liposomen – bestehend aus 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) – wurden als Modellmembran genutzt. Diesen wurde der Surfaktant Lysophosphatidylcholine (lysoPC) – von dem bekannt ist, dass er asymmetrisch in nur die äußere Schicht insertiert – zugesetzt.

Das erste Ziel dieser Arbeit war es, Methoden zur Trennung und Charakterisierung von Knospen und Muttervesikeln (MV) zu entwickeln. Für eine größenbasierte Trennung wurde Asymmetrische
Fluss Feld-Fluss Fraktionierung (AF4) gewählt. Unvermeidbare Verdünnungsprozesse der Methode führten dazu, dass ein Teil der Knospen aufgrund der Extraktion von LysoPC fusionierten. Für die Quantifizierung des Anteils an Knospen- und MV wurde eine Fluoreszenzsonde genutzt: 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (NBD-DSPE) erwies sich als geeignet. Da die Fusion der Knospen eine Basislinientrennung der Fluoreszenzsignale verhinderte, wurde eine Methode zur rechnerischen Dekonvolution der Beiträge entwickelt. Die Größe der Partikel wurde mit Hilfe des beschichtete-Kugel Modells der statischen Mehrwinkel-Lichtstreuung (MALS) bestimmt. Die Lipidzusammensetzung wurde durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) bestimmt.

Das zweite Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung des Systems POPC-lysoPC. Es zeigte sich, dass der Anteil an Knospen nur bis zu einem gewissen Stoffmengenverhältnis von lysoPC zu POPC zunahm. Die Theorie der „osmotischen Barriere“ wurde als Erklärung entwickelt: A priori nicht-sphärische Liposomen können demnach nur knospen, bis sie sphärisch sind – weitere Knospung müsste zur Ausbildung eines entgegengesetzten osmotischen Gradienten führen. Wie vermutet, erwies sich, dass bei ursprünglich „weniger-sphärischen“ Liposomen höhere Anteile an Knospen erreicht wurden. Calcein-Leckage-Experimente ließen vermuten, dass während der Ausbildung der Knospen, sowie bei den MV keine Leckage auftritt. Sie deuteten außerdem darauf hin, dass die interne osmotische Konzentration durch den Prozess der Knospung zunahm. Ein osmotischer Gradient baut sich also tatsächlich auf. Was die Stabilität der Knospen betrifft, so lecken diese wahrscheinlich und sind anfänglich instabil. Eine Fusion im Verhältnis zwei zu eins wurde theoretisiert.

Schlussendlich wurde ein Modell basierend auf geometrischen Überlegungen entwickelt: Die vorangehenden Ergebnisse legen nahe, dass eine Voraussage des Anteils an Knospen durch das Aufteilen des konservierten Innenvolumens, sowie der Oberfläche auf ein MV mit variablem Radius und eine variable Anzahl Knospen mit festem Radius für Liposomen von gesetzter „Spherizität“
möglich ist. Eine gute Übereinstimmung der derart berechneten mit den experimentell bestimmten Werten konnte bestätigt werden

Angaben zum Objekt

• Standort: Deutsche Nationalbibliothek Frankfurt am Main
• Umfang: Online-Ressource
• Sprache: Englisch
• Anmerkungen: Universität Freiburg, Dissertation, 2022

Klassifikation und Themen

• Schlagwort: Lipide ; Liposom ; Bimolekulare Lipidschicht

Beteiligte, Orts- und Zeitangaben

• Ereignis: Veröffentlichung
• (wo): Freiburg
• (wer): Universität
• (wann): 2022
• Urheber: Kaiser, Michael
• Beteiligte Personen und Organisationen: Heerklotz, Heiko ; Heerklotz, Heiko ; Süss, Regine ; Albert-Ludwigs-Universität Freiburg. Lehrstuhl für Pharmazeutische Technologie und Biopharmazie ; Albert-Ludwigs-Universität Freiburg. Fakultät für Chemie und Pharmazie

Weitere Informationen

• DOI: 10.6094/UNIFR/224018
• URN: urn:nbn:de:bsz:25-freidok-2240182
• Rechteinformation: Open Access; Der Zugriff auf das Objekt ist unbeschränkt möglich.
• Letzte Aktualisierung: 25.03.2025, 13:50 MEZ