Insertionsstabilität Cholesterol basierter PEG-Anker in Liposomen

Hochschulschrift

Zusammenfassung: Die Oberfläche von liposomalen Wirkstoffträgersystemen für die intravenöse Applikation kann zu verschiedenen Zwecken modifiziert werden. Zum einen wird die Anlagerung von Plasmabestandteilen durch Bildung einer sterischen Barriere verhindert und somit die Plasmahalbwertszeit verlängert. Zum anderen kann eine Akkumulation im erkrankten Gewebe erreicht werden (sog. Aktives Targeting). Sehr häufig wird hierfür bifunktionalisiertes Polyethylenglycol (PEG) verwendet, welches einen lipophilen Rest (Phospholipide (PL) oder Cholesterol (Chol)) zur Membranverankerung und eine reaktive Kopfgruppe (N-Hydroxysuccinimid (NHS) oder Maleimid) zur Kopplung an einen Liganden besitzt.Diese Ligand-PEG-Moleküle (Anker) können über Post-Insertions-Techniken (PIT) in präformulierte Liposomen eingelagert werden. PL-basierte PEG werden hierbei mit den Liposomen, abhängig von deren Lipidzusammensetzung, entweder bei 60 °C für 1 h oder 37 °C für 5 h inkubiert. Chol-PEG Moleküle können mittels Sterol-basierter Post-Insertions-Technik (SPIT) bei Raumtemperatur in weniger als 1 h spontan in die PL-Doppelschicht eingelagert werden. Der entscheidende Vorteil dieser Technik ist die geringe thermische Belastung der Vesikel, proteinogenen Liganden und intravesikulär verpackten Wirkstoffe.Die Insertion sowie Stabilität der Verankerung dreier Chol-PEG Moleküle wurden im Zuge der beschriebenen Versuchsreihen untersucht. Hierfür wurden zwei PEG-basierte Anker mit einer molaren Masse des PEG-Anteils von 1000 und 1500 Da neu synthetisiert und mit einem 2000 Da PEG-Anker verglichen. Mit Hilfe der zeitaufgelösten Pulsed-Field-Gradient Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (PFG-NMR) wurde das Zeitintervall, in welchem sich die Chol-PEG Moleküle in die Liposomen einlagern und es zur Membransättigung kommt, ermittelt. Des Weiteren wurde die absolute Menge an membrangebundenem Anker mittels radioaktiver Markierung quantifiziert.Um die Beständigkeit der Oberflächenmodifikation bei starker Verdünnung zu untersuchen, folgten Größenausschlusschromatographie- sowie Ultrazentrifugationsexperimente. Das Austauschverhalten der eingelagerten Chol-PEG Moleküle bei Anwesenheit zusätzlicher Membranen wurde mittels Free Flow Elektrophorese (FFE) untersucht. Hierbei wurden die oberflächenmodifizierten Liposomen (Donor-Vesikel) in verschiedenen molaren Verhältnissen mit nicht modifizierten, negativ geladenen Akzeptor-Liposomen inkubiert und anschließend via FFE getrennt.Im Zuge dieser Arbeit wurde ebenfalls die Umverteilung der liposomal gebundenen Chol-PEG Moleküle auf Bestandteile des humanen Plasmas untersucht. Hierbei konnten die einzelnen Plasmaproteine sowie die noch vorhandenen Liposomen nach erfolgter Inkubation mit Hilfe der Asymmetrischen Fluss Feld-Fluss Fraktionierung (AF4) getrennt und anschließend untersucht werden.Während der gesamten Versuche zeigte sich, dass sich bei Verwendung von Ankern mit höherer molarer Masse prozentual weniger Chol-PEG in Liposomen einlagert und dort verbleibt. Zusätzlich wurde im Zuge der Ultrazentrifugationsversuche beobachtet, dass die Desorption der Anker von der Lagerungszeit abhängig ist.Diese Experimente stellen in ihrer Art die ersten Stabilitätsuntersuchungen nach erfolgter Insertion von Chol-PEG mittels Sterol-basierter Post-Insertions-Technik (SPIT) dar
Zusammenfassung: The outer membrane leaflets of liposomal drug carrier systems applied intravenously may be altered to achieve (i) a prolonged circulation time due to a steric barrier that hinders plasma protein adsorption, and (ii) an accumulation at diseased tissues (so-called active targeting). To this end, bifunctionalised poly(ethylene glycol) (PEG) molecules consisting of a reactive head group, such as N-hydroxysuccinimide (NHS) or maleimide for ligand coupling purposes and a lipophilic residue (phospholipid (PL) or cholesterol (Chol)) for membrane anchorage are frequently used.These ligand-PEG molecules (anchors) can be inserted into preformed liposomes via post-insertion techniques (PIT). PL-based anchors are inserted either at 60 °C for 1 h or at 37 °C for 5 h, depending on the composition of the liposomes used. The insertion of Chol-PEG molecules into liposomal membranes takes place spontaneously at room temperature within less than one hour using a technique called sterol-based post-insertion technique (SPIT). The main advantage of this technique is the absence of thermal stress exerted on thermosensitive biomolecules that are frequently used as ligands or on active substances used as payloads.In this study insertion efficiencies and stabilities of three different types of Chol-PEG molecules with molar PEG masses of 1000, 1500 (both synthesized for this purpose) and 2000 Da were investigated. Furthermore, the time interval for anchor insertion and saturation of liposomal membranes was examined via pulsed-field-gradient nuclear magnetic resonance spectroscopy (PFG-NMR). The absolute portion of inserted anchor was quantified using radiolabeled Chol-PEG molecules. To gain a deeper insight into the stability of anchor insertion upon dilution, size exclusion chromatography (SEC) and ultracentrifugation (UC) experiments were performed. Using the donor-acceptor principle, the exchange of Chol-PEG was investigated via free flow electrophoresis (FFE). The experimental setup consisted of surface-modified liposomes (donor) and unmodified, negatively charged acceptor liposomes, which were mixed in different molar ratios. The portion of Chol-PEG that migrated from donor to acceptor was quantified. The redistribution of Chol-PEG-modified liposomes under physiological conditions was addressed by incubating surface-modified liposomes with human plasma. Subsequently, plasma proteins and remaining liposomes were separated using asymmetric flow field-flow fractionation (AF4). Within all these experiments higher molar PEG masses correlated with a decreased insertion efficiency and anchoring stability. Additionally, a dependence of Chol-PEG desorption and incubation time was observed in UC experiments. Here, investigations on the anchoring stability of Chol-PEG molecules after their insertion via sterol-based post-insertion technique (SPIT) are reported for the first time

Angaben zum Objekt

• Standort: Deutsche Nationalbibliothek Frankfurt am Main
• Umfang: Online-Ressource
• Sprache: Deutsch
• Anmerkungen: Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, Dissertation, 2015

Klassifikation und Themen

• Schlagwort: Ankergruppe ; Polyethylenglykolderivate ; Cholesterin ; Kritische Micell-Bildungskonzentration ; Liposom ; Polyethylenglykolderivate ; Arzneimittelentwicklung ; Arzneimitteldesign

Beteiligte, Orts- und Zeitangaben

• Ereignis: Veröffentlichung
• (wo): Freiburg
• (wer): Universität
• (wann): 2015
• Urheber: Molnar, Daniel
• Beteiligte Personen und Organisationen: Schubert, Rolf

Weitere Informationen

• DOI: 10.6094/UNIFR/10443
• URN: urn:nbn:de:bsz:25-freidok-104435
• Rechteinformation: Der Zugriff auf das Objekt ist unbeschränkt möglich.
• Letzte Aktualisierung: 14.08.2025, 10:55 MESZ