The mechanism of NADH oxidation by respiratory complex I with focus on the production of reactive oxygen species

Abstract: Die NADH:Ubichinon Oxidoreduktase, der respiratorischer Komplex I, koppelt den Elektronentransfer von NADH zu Ubichinon mit der Translokation von vier Protonen über die Membran. Der mitochondrielle Komplex I besteht aus 45 Untereinheiten, das homologe bakterielle Enzym hingegen aus 13 bis 15 Untereinheiten. 14 Untereinheiten sind in allen Organismen konserviert und stellen die katalytischen Kernuntereinheiten dar. Die Struktur der Kernuntereinheiten sind im bakteriellen und mitochondrialen Enzym identisch angeordnet. Der bakterielle Komplex I stellt somit ein strukturelles Minimalmodel des mitochondriellen Enzymes dar. Komplex I oxidiert NADH durch ein FMN, das seine Elektronen über eine Kette von sieben Eisen-Schwefel-Zentren (Fe‑S) auf Ubichinon überträgt. Ein achtes (Fe-S)-Zentrum in der Nähe des FMN, N1a, ist in allen Organismen konserviert, aber nicht Teil der Elektronentransferkette zum Chinon. Die Rolle von N1a in der Katalyse des Komplex I ist nicht verstanden. Die NADH-Bindestelle ist Solvenzexponiert und der Ort der Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies. Komplex I ist einer der Haupterzeuger von ROS und seine Dysfunktion wurde mit verschiedensten Krankheiten in Verbindung gebracht, so zum Beispiel mit Leigh-Syndrom, einer schweren neurodegenerativen Störung.
Im Rahmen dieser Doktorarbeit sollte die Funktion des (Fe-S)-Zentrums N1a durch ortsgerichtete Mutagenese und enzymkinetische und strukturelle Untersuchungen bestimmt werden. Darüber hinaus sollten die Mutationen, die in Patienten mit dem Leigh-Syndrom gefunden wurden, in den bakteriellen Komplex I gebracht werden und die Auswirkungen auf Struktur und Funktion beschrieben werden. Schließlich sollte die NADH-Bindestelle über die Wirkung spezifischer Inhibitoren charakterisiert werden.
Die Reduktion des peripheren (Fe-S)-Zentrums war selbst mit schnellen optischen Stopped-flow Messungen nicht nachweisbar. Über EPR-Spektroskopie von Proben, die mit der Freeze-Quench Technik schnell eingefroren wurden, zeigte sich, dass in einer Komplex I- Variante, in der N1a nicht mehr durch NADH reduziert werden kann, die Tunnelrate der übrigen Elektronentransfer-Schritte unbeeinflusst blieb. Weitere Untersuchungen zeigten, dass N1a die Bindung von NADH beeinflusst. Die Geschwindigkeit der Komplex I katalysierten NADH/Ferrizyanid Oxidoreduktaseaktivität ist dramatisch verlangsamt, wenn die Reaktion mit Ferrizyanid anstelle von NADH gestartet wird. Detaillierte enzymkinetische Analysen zeigten, dass die vorherige Reduktion der (Fe-S)-Zentren eine Konformationsänderung auslöst, die dazu führt, dass das Produkt NAD+ die Bindestelle blockiert. Bei der Variante, die N1a enthält, das nicht durch NADH reduziert werden kann, tritt dieser Effekt nicht auf. Dies zeigt, dass die Reduktion von N1a zu einer verringerten Dissoziation von NAD+ führt. Strukturelle Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe zeigten, dass die Reduktion von N1a in der Tat eine konformative Änderung in der NADH-Bindestelle zur Folge hat. Die ROS-Produktion durch den Komplex I ist wesentlich erhöht, wenn dieser Mechanismus durch Mutationen ausgeschaltet wird.
Weiterhin wurden in dieser Arbeit Methoden zur Thermostabilität von Proteinen etabliert, die entweder auf die Freisetzung eines fluoreszenten Kofaktors oder der Bindung von fluoreszenten Markern beruht. Die Methoden wurden auf verschiedene Proteine angewendet und es zeigte sich, dass sie sich gegenseitig komplementieren. Mit Hilfe dieser Ansätze konnte ein neuer Puffer für die Reinigung des Komplex I etabliert werden.
In einem weiteren Projekt wurden die Mutationen, die in Patienten mit Leigh Syndrom beschrieben wurden, in den bakteriellen Komplex von E. coli sowie das Elektroneneingangs-modul des Komplex I aus A. aeolicus eingebracht. Mit den Präparationen der E. coli Komplex I Varianten wurde die Auswirkung auf die enzymatischen Aktivitäten untersucht, mit den Präparationen des Moduls aus A. aeolicus die strukturellen Konsequenzen. Die eingebrachten Mutationen hatten zur Folge, dass die Aktivität des Komplexes verringert ist, dass die Produktion von H2O2 erhöht ist, dass das Mittenpunktspotential des Flavins verändert wird und dass das Protein, insbesondere an der FMN-Bindestelle, destabilisiert ist. Entscheidend für die Ausprägung des Leigh Syndroms ist vermutlich die Aktivitätsverminderung und die Erhöhung der ROS-Produktion.
Um neuartige Inhibitoren herzustellen, die möglicherweise in der Lage sind, selektiv die ROS-Produktion am Komplex I zu vermindern, wurde die Struktur des spezifischen und hoch wirksamen Hemmstoffs NADH-OH als Leitstruktur für eine Strukturbasierte und Fragmentbasierte Molekülstrukturentwicklung verwendet. Mehrere so identifizierte Moleküle wurden als Komplex I- Inhibitoren identifiziert. Allerdings zeigen sie eine noch zu geringe Affinität zum Enzym
Abstract: The NADH:ubiquinone oxidoreductase, respiratory complex I, couples the transfer of electrons from NADH to ubiquinone with the translocation of four protons across a membrane. The mitochondrial complex I consists of 45 subunits, which the homologous bacterial one was shown to be composed of 13-15 subunits. 14 subunits are conserved in all organisms and represent the catalytic core subunits. The structures of the complex of bacteria and mitochondria is virtually identical. Thus, the bacterial enzyme represents a minimal structural model of mitochondrial complex I. Complex I oxidizes NADH by FMN and transfers the electrons to the quinone by a chain of seven (Fe-S)-clusters. An eighth cluster, located proximally to FMN, N1a, is conserved in the complex from all kingdoms of life, but not involved in the electron transfer to quinone. Hence, its role for catalysis remains enigmatic. The NADH oxidation site is susceptible of producing reactive oxygen species due to its solvent exposure. Complex I is known to be the major producer of cellular ROS and its dysfunction is associated with a multitude of severe diseases, such as the Leigh syndrome, a severe neurodegenerative disease.
In this work, the function of N1a should be identified by means of site-directed mutagenesis, enzymatic kinetics and structural analysis. Mutations found in patients suffering from Leigh syndrome should be introduced into bacterial complex I to identify the effects on structure and function. Finally, competitors to NADH binding should be identified that selectively inhibit ROS production.
Reduction of the peripheral cluster N1a could not be detected even using fast stopped-flow kinetics. However, EPR spectroscopy of samples that were generated by the ultra-fast freeze quenching revealed that the electron tunneling rates in a complex I variant containing N1a that cannot be reduced by NADH do not change. However, reduction of N1a regulates NADH binding. The rate of the complex I catalyzed activity is significantly diminished when the reation is initiated by an addition of ferricyanide instead of NADH. Detailled enzyme kinetics revealed that reduction of the (Fe-S)-clusters leads to a conformational change that in turn leaves the product NAD+ in its binding site blocking the access of NADH. This effect was not detectable in the variant with N1a that is not reducible by NADH. Thus, the reduction of N1a leads to a lower dissociation constant of NAD+. Structural investigations in our group revealed the local structural changes in the NADH binding site due to N1a reduction. Elimination of this mechanism by site-directed mutagenesis leads to an enhanced ROS production.
Furthermore, techniques were established to determine the thermal stability of proteins. They are based on the release of a fluorescent cofactor or the binding of a fluorescent marker. Several proteins were characterized by this methods revealing their complementarity. A novel buffer for the purification of complex I was established using these methods.
Mutations found in patients suffering from Leigh syndrome were introduced into E. coli complex I and the electron input modul of the compex from Aquifex aeolicus. The consequences of the mutations on the catalytic properties were tested with the E. coli variants and structural consequences were determined in the structure of the A. aeolicus modul. The mutations caused a reduced activity, an increase in H2O2 production, a change of the flavin midpoint potential and a reduced thermal stability of the enzyme, especially at the flavin site. It seems that Leigh syndrome is mainly caused by a reduced enzymatic activity paired with an increased H2O2 production.
To discover new structures that are possibly capable to reduce ROS production at the reduced FMN cofactor in complex I a combination of structure-based and fragment-based drug design with the highly specific complex I inhibitor NADH-OH as lead structure was used. Several possible binders were identified and their inhibitory effect on the NADH oxidase activity was determined. The structure of two compounds bound to NuoEF were successfully solved and identified a binding site within the NADH oxidation site. However, these compounds showed a low affinity to the complex

Object Details

• Location: Deutsche Nationalbibliothek Frankfurt am Main
• Extent: Online-Ressource
• Language: Englisch
• Notes: Universität Freiburg, Dissertation, 2018

Classification and Topics

• Classification: Biowissenschaften, Biologie
• Keyword: Reaktive Sauerstoffspezies ; Atmungskette ; Leigh-Encephalomyelopathie ; NADH-Dehydrogenase ; Nervendegeneration ; Mitochondriopathie ; Riboflavinphosphat ; Escherichia coli ; Aquifex aeolicus ; Rind ; Wasserstoffperoxidradikal ; Kristallisation ; Kristallstrukturanalyse ; NADH-Dehydrogenase ; NADH ; Arzneimitteldesign ; Inhibitor ; Ferricyanide ; FPLC-System ; Lipide ; Mikrobiologe

Contributors, Places and Time

• Event: Veröffentlichung
• (where): Freiburg
• (who): Universität
• (when): 2018
• Creator: Gnandt, Emmanuel
• Contributor: Friedrich, Thorsten ; Einsle, Oliver ; Albert-Ludwigs-Universität Freiburg. Fakultät für Chemie und Pharmazie

Further information

• DOI: 10.6094/UNIFR/16298
• URN: urn:nbn:de:bsz:25-freidok-162980
• Rights: Kein Open Access; Der Zugriff auf das Objekt ist unbeschränkt möglich.
• Last update: 14.08.2025, 10:59 AM CEST