Enzymatic asymmetric reduction of isolated carbon−carbon double bonds by archaeal geranylgeranyl reductases

Abstract: Die stereo-, regio- und chemoselektive Reduktion isolierter C=C-Bindungen ist eine schwer zugängliche chemische Reaktion, welche in der Regel mithilfe von Übergangsmetall-katalysatoren durchgeführt wird. Biokatalytische Ansätze sind bislang nicht etabliert. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die asymmetrische enzymatische Reduktion isolierter C=C Bindungen erforscht. Hierzu wurden Geranylgeranyl Reduktasen (GGR) aus Archaeen ausgewählt, welche C20 Geranylgeranylseitenketten in der Biosynthese von Membranlipiden reduzieren. Die GGR aus Archaeoglobus fulgidus (AfGGR, Gen: af_0464), Sulfolobus acidocaldarius (Gen: saci_0986) und Thermoplasma acidophilum (Gen: ta0516m) wurden in E. coli produziert und das Substratspektrum sowie die Selektivität der Reaktion untersucht.
Durch die Umsetzung der azyklischen C25- bis C10-Terpenalkohole wurde gezeigt, dass die tensidische Lipidstruktur nicht für die Aktivität der GGR notwendig ist, wobei längerkettige Terpene bis zu der Länge des physiologischen Substrates Geranylgeraniol besser umgesetzt wurden. Darüber hinaus reduzierten die getesteten GGR Terpenketten mit verschiedenen Kopfgruppen, wie Ester, Diels–Alder Produkte oder aromatische Reste. Die langsamere Reduktion der proximalen C=C Bindung deutet auf einen inhibitorischen Effekt einer angrenzenden funktionellen Gruppe hin. Durch die Einführung eines Bernsteinsäure-Hemiesters mit einer negativen Ladung, welche mit der Anionenbindetasche der GGR interagiert, und einer Alkylkette als „Spacer“, welcher die Distanz zwischen Anionenbindetasche und aktivem Zentrum überbrückt, wurde die Umsetzung verbessert. Dadurch wurden auch kleinere nicht akzeptierte Alkohole wie Prenol als Hemisuccinat reduziert.
Die Reduktion von Geranylgeranyl-, Farnesyl- und Geranylderivaten erfolgt (R) selektiv und deutet auf eine stereoselektive Reaktion, unabhängig von der Kettenlänge und Kopfgruppe des Substrates hin. Bezüglich der Regio- und Chemospezifität wurde keine Umsetzung von ethylsubstituierten, zyklischen, unverzweigten oder Z-konfigurierten Doppelbindungen beobachtet. Azyklische methylsubstituierte E-konfigurierte C=C Bindungen wurden jedoch selektiv in Gegenwart nicht akzeptierter Doppelbindungen reduziert. Außerdem wurde gezeigt, dass Z-konfigurierte Bindungen sowie Methoxy-Gruppen das aktive Zentrum passieren können und dadurch die darauffolgende E-konfigurierte C=C Bindung reduziert werden kann.
Die Substratuntersuchungen zu GGR wurden mit Natriumdithionit als Regenerierungssystem durchgeführt. Ein alternatives enzymatisches Regenerierungssystem wurde untersucht. GGR zeigten eine geringe Produktbildung in zellfreien E. coli Lysaten und der Verwendung eines Glukose Dehydrogenase (GDH)–Glukose-Systems zur Regenerierung von NAD(P)H. Die dafür verantwortlichen Proteine wurden nicht gefunden. Anstatt der heterologen Regenerierung, wurde das physiologische regenerierende Enzym von AfGGR als Ferredoxin (AfFer, Gen: af_1185) identifiziert. Die Testungen mit AfFer in zellfreiem E. coli Lysat und unter Zugabe des NAD(P)H-Regenerierungssystems zeigten eine höhere Umsetzung als ohne die Zugabe von AfFer. Demnach erfolgte die Regenerierung von AfFer durch ein NAD(P)H-abhängiges Protein aus E. coli. Das verantwortliche Enzym wurde als Flavodoxin/Ferredoxin–NADP-Reduktase (FNR, E. coli Gen: fpr) identifiziert und die gereinigte AfGGR–AfFer–FNR–GDH-Kaskade wurde als funktionierendes Regenerierungssystem bestätigt. Eine Verwendung von AfFer zur Regenerierung anderer GGR war nicht möglich und zeigt eine Selektivität des archaealen Ferredoxins gegenüber der GGR aus dem Ursprungsorganismus.
GGR sind vielversprechende Biokatalysatoren für die Reduktion isolierter C=C-Bindungen. Die Anwendung des Katalysators erlaubt die Reduktion E-konfigurierter methylverzweigter azyklischer C=C Bindungen, erfolgt (R)-selektiv und unter Ausschluss anderer Arten von Doppelbindungen. Diese Selektivität und Spezifität ist eine Herausforderung für etablierte Übergangsmetallkatalysatoren und macht die Enzymkatalyse zu einer möglichen Ergänzung für die Synthesechemie
Abstract: The stereo-, regio-, and chemoselective reduction of isolated C=C bonds is a challenging reaction in chemistry, which is mainly performed by transition-metal catalysis, while biocatalytic approaches are missing. This work investigates the asymmetric biocatalytic reduction of isolated C=C bonds. For this purpose, possible candidates were screened, and geranylgeranyl reductases (GGRs), reducing C20 geranylgeranyl diphosphate and the corresponding side chains of membrane phospholipids, were identified as a promising subject for further studies. Archaeal GGRs from Archaeoglobus fulgidus (AfGGR, gene: af_0464), Sulfolobus acidocaldarius (gene: saci_0986), and Thermoplasma acidophilum (gene: ta0516m) were produced in E. coli, and their substraterange, as well as their stereo- and regio-selectivity were studied.
Herein, it was demonstrated that the surfactant lipid structure is not mandatory for the reaction, as GGRs reduced acyclic C25–C10 terpene alcohols. The reduction of longer terpene chains up to the physiological C20-terpenes was preferred. Conversion was also observed for substrates with varying head groups, including ester, Diels–Alder, or aromatic substituents. The proximal C=C bond was reduced slowly, indicating an inhibitory effect of an adjacent functional group. The conversion was improved by introducing hemisuccinates, providing an anionic charge, interacting with an anion-binding pocket of GGRs, and acting as a spacer, bridging the distance between anion-binding pocket and active site. This way, fully reduced product and higher conversions were obtained. Additionally, small substrates such as prenol, which were not reduced as alcohol, were accepted as hemisuccinates.
The reaction occurs strictly (R) selective for geranygeranyl, farnesyl, and geranyl derivatives indicating stereoselective reduction independent of chain length and head group. Regarding the regio- and chemospecificity, no reduction was observed for ethyl-substituted, cyclic, terminal, unbranched, or Z configured C=C bonds. However, acyclic, E configured, methyl-branched C=C bonds were selectively reduced in the presence of other types of double bonds. In addition, reduction is detectable when a Z-configured double bond or a methoxy group must pass the active site before the reduction of the following E configured C=C bond.
The substrate investigations with GGRs were performed with sodium dithionite as a regenerating agent. An alternative enzymatic regeneration system, that can be coupled to the current established cofactor-regeneration systems for NAD(P)H, was investigated. GGRs showed (minor) activity in cell-free extracts of E. coli, but the proteins responsible for the regeneration were not found. Instead of a heterologous system, the physiological regenerating enzyme of AfGGR was identified as ferredoxin (AfFer, gene: af_1185). The ferredoxin improved conversion in E. coli cell-free extracts and by addition of the glucose dehydrogenase (GDH)–glucose system for NAD(P)H regeneration. Thus, AfFer was regenerated NAD(P)H-dependent by E. coli proteins. The flavodoxin/ferredoxin–NADP reductase (FNR, E. coli gene: fpr) was isolated, and the entire cascade AfGGR–AfFer–FNR–GDH was tested with purified enzymes, proving a functional regeneration system for AfGGR. The ferredoxin did not affect other GGRs indicating selective interaction between archaeal ferredoxin and the GGR from the originating organism.
In conclusion, GGRs are promising biocatalysts for the reduction of isolated C=C bonds. The catalysts’ scope encompasses E-configured, methyl-branched, acyclic C=C bonds. The reduction occurs strictly stereoselectively and discriminates other kinds of double bonds, which is challenging for transition-metal approaches, making enzymatic catalysis a valuable complement to synthetic chemistry

Object Details

• Location: Deutsche Nationalbibliothek Frankfurt am Main
• Extent: Online-Ressource
• Language: Englisch
• Notes: Universität Freiburg, Dissertation, 2022

Classification and Topics

• Keyword: Reductasen ; Biokatalyse ; Flavine ; Ferredoxine ; Reductasen ; Archaebakterien ; Terpene ; Reduktion

Contributors, Places and Time

• Event: Veröffentlichung
• (where): Freiburg
• (who): Universität
• (when): 2023
• Creator: Niese, Richard
• Contributor: Müller, Michael ; Boll, Matthias ; Hüttel, Wolfgang ; Pharmazeutische und Medizinische Chemie, AK Prof. Dr. Michael Müller ; Albert-Ludwigs-Universität Freiburg. Fakultät für Chemie und Pharmazie

Further information

• DOI: 10.6094/UNIFR/232949
• URN: urn:nbn:de:bsz:25-freidok-2329498
• Rights: Open Access; Der Zugriff auf das Objekt ist unbeschränkt möglich.
• Last update: 25.03.2025, 1:44 PM CET