Maturation of nitrous oxide reductase by the ABC transporter complex NosDFY(L)

Abstract: Der Klimawandel ist eine der größten Herausforderungen, mit denen die Erdbevölkerung heute konfrontiert ist. Mit einem Anteil von 5-10 % ist Lachgas (Distickstoffmonoxid, N2O), nach Kohlenstoffdioxid (CO2) und Methan (CH4), das drittwichtigste anthropogene Treibhausgas. Darüber hinaus hat N2O relevante ozonabbauende Eigenschaften und gilt in dieser Hinsicht als die kritischste menschliche Emission des 21. Jahrhunderts. Die meisten vom Menschen verursachten N2O-Emissionen werden auf die Landwirtschaft zurückgeführt, in der immer mehr Stickstoff-Dünger für eine effizientere Nahrungsmittelproduktion eingesetzt wird um so dem Bedarf einer stetig steigenden Weltbevölkerung Rechnung zu tragen. Die mikrobielle Reduktion von Nitrat (NO3-) zu Stickstoff (N2), ein mehrstufiger Prozess, der Denitrifizierung genannt wird, konkurriert mit der Stickstoff-Aufnahme der Pflanzen und verringert dadurch die Effektivität des Düngers. Der letzte Schritt, die Reduktion von N2O zu N2, wird von dem Cu-abhängigen Enzym N2O-Reduktase (NosZ) katalysiert. Dieses Enzym stellt das schwächste Glied in der Kette der Denitrifikation dar und verursacht so signifikante N2O-Emissionen. Ein Grund dafür ist die Empfindlichkeit von NosZ gegenüber Sauerstoff, welcher zum Zerfall des aktiven Zentrums, des einzigartigen [4Cu:2S] Clusters (CuZ), führen kann. Der Mechanismus der N2O-Reduktion durch das CuZ-Zentrum und seine Assemblierung sind noch kaum erforscht. Letztere erfordert eine komplexe Protein-Maschinerie, die im selben Operon codiert ist wie NosZ. Das Ausschalten eines der Gene des ATP-binding cassette (ABC) Transporters NosDFY führte zu einem CuZ-defizienten und damit inaktiven NosZ.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Interaktion des ABC-Transporters NosDFY mit NosZ und dem membranverankerten Cu-Chaperon NosL von Pseudomonas stutzeri strukturell und funktionell analysiert. Atomare Modelle wurden für NosDFY und NosDFYL durch Kryo-Elektronenmikroskopie und Röntgenkristallographie erhalten. Es wurde gezeigt, dass die Bindung von NosD an NosFY innerhalb der Transmembrandomänen stattfindet, was eine neuartige Interaktion eines ABC-Transporter-assoziierten Proteins darstellt. Die NosDFYL-Struktur zeigte eine Cu/Zn-Bindestelle, die sich an der Schnittstelle von NosD und L befindet und zum ersten Mal eine Interaktion zwischen einem ABC-Transporter und einem membranverankerten Lipoprotein zeigt. Mutationsstudien deuten darauf hin, dass die Cu-Insertion in NosZ von drei konservierten Seitenketten auf der Oberfläche von NosD abhängig ist, den selben Aminosäuren, die auch die Cu-Bindestelle mit NosL bilden. Konformations¬änderungen von NosDFY wurden durch die Kryo-EM-Struktur einer ATP-gebundenen Variante aufgeklärt. Außerdem wurde ein intermediärer Komplex dieser Variante mit NosZ isoliert, was zu der Hypothese einer energiegekoppelten NosZ-Reifung führte
Abstract: Climate change is one of the greatest challenges that Earth’s population is facing today. Nitrous oxide (N2O) accounts for about 5-10 % of the anthropogenic greenhouse effect making it the third most severe pollutant after carbon dioxide (CO2) and methane (CH4). Additionally, N2O has relevant ozone-depleting properties and in this respect is considered the most critical human emission of the 21st century. Most of the human-caused N2O emissions can be traced back to agriculture, where rising amounts of nitrogen-based fertilizers are used for efficient food production, satisfying the demand of a steadily increasing world population. Microbial reduction of nitrate (NO3-) to dinitrogen (N2), a multi-step process called denitrification, competes with nitrogen uptake of plants and therefore decreases the efficiency of these fertilizers. The last step, the reduction of N2O to N2, is catalyzed by Cu-dependent nitrous oxide reductase (NosZ). This enzyme represents the weakest link in the chain of denitrification, causing significant release of N2O. One reason behind this is the sensitivity of NosZ towards oxygen that can lead to a decomposition of the enzyme’s active site, a unique [4Cu:2S] cluster (CuZ). The mechanism of N2O reduction by the CuZ center and its assembly is still poorly understood. The enzyme requires a complex maturation machinery, encoded within the same operon as nosZ. Knock-outs of any of the genes encoding for the ATP-binding cassette (ABC) transporter NosDFY were shown to result in CuZ-deficient and thus inactive NosZ.
In the course of this study, the interaction of the ABC transporter NosDFY with NosZ and the membrane-anchored Cu chaperone NosL from Pseudomonas stutzeri were analyzed structurally and functionally. Atomic models for NosDFY and NosDFYL were obtained by cryo-electron microscopy (cryo-EM) and X-ray crystallography. The binding of NosD to NosFY was shown to occur within the transmembrane domains, a novel interaction of an ABC transporter associated protein. The NosDFYL structure revealed a Cu/Zn site located at the interface of NosD and L and, for the first time, shows an interaction between an ABC transporter and a membrane-anchored lipoprotein. Mutational studies suggest that Cu insertion into NosZ is dependent on three conserved residues on the surface of NosD, the same residues involved in building up the Cu site with NosL. Conformational changes of NosDFY were visualized by the cryo-EM structure of an ATP-bound variant. Additionally, an intermediate complex of this variant with NosZ was isolated, giving rise to the hypothesis of an energy-coupled NosZ maturation

Object Details

• Location: Deutsche Nationalbibliothek Frankfurt am Main
• Extent: Online-Ressource
• Language: Englisch
• Notes: Universität Freiburg, Dissertation, 2020

Classification and Topics

• Classification: Biowissenschaften, Biologie
• Keyword: Kryoelektronenmikroskopie ; ABC-Transporter ; Distickstoffmonoxid

Contributors, Places and Time

• Event: Veröffentlichung
• (where): Freiburg
• (who): Universität
• (when): 2020
• Creator: Müller, Christoph
• Contributor: Einsle, Oliver ; Albert-Ludwigs-Universität Freiburg. Fakultät für Chemie und Pharmazie

Further information

• DOI: 10.6094/UNIFR/166190
• URN: urn:nbn:de:bsz:25-freidok-1661909
• Rights: Open Access; Der Zugriff auf das Objekt ist unbeschränkt möglich.
• Last update: 25.03.2025, 1:53 PM CET