Investigations on ABC and MFS transporters of Streptomyces spp

Hochschulschrift

Zusammenfassung: Bei ABC- (ATP binding cassette) und MFS- (major facilitator superfamily) Transportern handelt es sich um zwei der größten Membranprotein-Familien. Transporter dieser Familien sind für die Aufnahme von zahlreichen, essentiellen Molekülen des Stoffwechsels der Zelle oder für den Efflux von Toxinen und anderen, strukturell unterschiedlichen Substanzen verantwortlich. In dieser Arbeit wurde die Bedeutung von ABC- und MFS-Transporter zweier Streptomyceten-Stämme in der Sekundärmetabolit-Biosynthese untersucht. Rishirilid B ist ein PKS Typ II Metabolit, der von Streptomyces bottropensis Goe C4/4 gebildet wird. Das entsprechende Gencluster enthält die vier Transportergene rslT1-4. Die Gene rslT1-3 kodieren für einen ABC-Transporter. Das Auftreten des Substratbindeproteins (SBP) RslT1 lässt vermuten, dass es sich hierbei um ein Aminosäure-Importsystem handelt. Der von rslT4 kodierte Multidrug-Transporter zählt zur MFS-Familie wobei dessen Transkription vom MarR Regulator RslR4 kontrolliert wird. Das Rishirilid-Gencluster liegt auf dem Cosmid cos4 und wurde in Streptomyces albus J1074 heterolog exprimiert. Inaktivierungsexperimente der Transporter wurden mittels Redirected© Technologie durchgeführt. Die Deletion und Überexpression von rslT1-3 zeigen, dass dieses Importsystem die Rishirilid B-Produktion beeinflusst. Diese Ergebnisse führen zu der Annahme, dass es sich bei RslT123 um einen ABC-Transporter für die Aufnahme einer Vorstufe handelt, welche für die Biosynthese von Rishirilid B benötigt werden. Als Startereinheit für die PKS-Synthese von Rishirilid B wurde Isobutyryl postuliert, welches als Derivat des Valin-Katabolismus beschrieben wird. Anhand dieser Postulate liegt die Vermutung nahe, dass RslT123 am Import von Aminosäuren beteiligt ist. Diverse Versuche der Aufreinigung des SBP zur Bestimmung dessen Substratspezifität schlugen fehl. Durch die Deletion und Überexpression von RslT4 sowie MarR Regulator RslR4 konnte ein Regulationsmechanismus der Rishirilid B–Biosynthese postuliert werden. Da die Deletionmutante ∆rslT4 jedoch Rishirilid überproduziert, übernehmen vermutlich andere Transporter von S. albus dessen Aufgabe. Die Fähigkeit des MFS Transporter RslT4, Antibiotika aus der Bakterienzelle auszuschleusen, wurde mittels MIC- und Agardiffusionstests bestimmt.Zusätzlich wurde die Genomsequenz von Streptomyces sp. Tü6071 mittels der bioinformatischer Plattform Galaxy ausgewertet. Ziel war die Identifizierung von Transportergenen, wobei der Fokus auf solchen lag, die an der Biosynthese von Sekundärmetaboliten beteiligt sind. S. sp. Tü6071 produziert die Terpenoide Phenalinolacton A-D. Die Untersuchung der Genomsequenz lässt die Beteiligung der drei ABC Transportergene plaABC1-3 an derer Synthese vermuten. Die Inaktivierung von plaABC1 durch homologe Rekombination zeigte keinen Zusammenhang des ABC-Transporters mit der Phenalinolacton-Biosynthese. Allerdings konnte ein Einfluss von plaABC1 auf die Bildung des Luftmyzels von S. sp. Tü6071 gezeigt werden
Zusammenfassung: ABC (ATP binding cassette) and MFS (major facilitator superfamily) transporters are the two largest families of membrane proteins involved in the import and export of substances across biological membranes. Members of these families have been described for the up-take of a variety, necessary molecules which belong to cell metabolism or for the efflux of toxins and multiple structurally unrelated drugs. In this work ABC and MFS transporters of two Streptomyces spp. have been investigated for their implication in the biosynthesis of two secondary metabolites.Rishirilide B is a type II PKS metabolite produced by Streptomyces bottropensis Goe C4/4 and its gene cluster includes four transporter genes, rslT1-4. An ABC transporter is encoded by rslT1-3 which were predicted to compose an amino acid importer system defined by the substrate binding protein (SBP) RslT1. The multidrug transporter encoded by rslT4 belongs to the MFS and its transcription is controlled by RslR4, a MarR regulator. Inactivation experiments of these transporter genes were performed by Redirect© Technology in the cosmid cos4 which contained rishirilide cluster, for its heterologous expression in Streptomyces albus J1074. Deletion and overexpression experiments of rslT1-3 indicated the capacity of the importer system to affect rishirilide B production. It was therefore suggested that the ABC transporter is responsible for the uptake of a precursor needed for the biosynthesis of rishirilide B. Isobutyryl was proposed as the starter unit for the PKS biosynthesis of rishirilide B and was described to derivate from the valine catabolism. Based on these assumptions, RslT123 was suggested to be involved in the import of this amino acid. Attempts to purify the SBP to prove its substrate specificity failed. Furthermore, deletion and overexpression experiments of the MFS transporter RslT4 and its regulator RslR4 led to the proposal of a regulatory mechanism for the biosynthesis and export of rishirilide B. However, rishirilide B production increased in the ΔrslT4 mutant indicating that another transport mechanism of the host took over the function. The multidrug efflux capacity of RslT4 was determined by MIC and disc diffusion assays.In addition, analysis of the genome sequence of Streptomyces sp. Tü6071 was executed with the help of the bioinformatics platform Galaxy with a focus on transporter genes. S. sp. Tü6071 is responsible for the production of the terpenoids phenalinolactones A-D. Investigations on the genome sequence to identify transporter genes involved in the biosynthesis of these secondary metabolites led to the prediction of three ABC transporter genes, plaABC1-3. Inactivation experiments of plaABC1 by homologous recombination did not show a connection of the ABC transporter to phenalinolactones but implied a role in aerial mycelium formation

Angaben zum Objekt

• Standort: Deutsche Nationalbibliothek Frankfurt am Main
• Umfang: Online-Ressource
• Sprache: Englisch
• Anmerkungen: Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, Dissertation, 2015

Klassifikation und Themen

• Klassifikation: Biowissenschaften, Biologie
• Schlagwort: ABC-Transporter ; Streptomyces

Beteiligte, Orts- und Zeitangaben

• Ereignis: Veröffentlichung
• (wo): Freiburg
• (wer): Universität
• (wann): 2015
• Urheber: Santillana Larraona, Irene
• Beteiligte Personen und Organisationen: Bechthold, Andreas

Weitere Informationen

• DOI: 10.6094/UNIFR/10171
• URN: urn:nbn:de:bsz:25-freidok-101716
• Rechteinformation: Der Zugriff auf das Objekt ist unbeschränkt möglich.
• Letzte Aktualisierung: 25.03.2025, 13:53 MEZ