Charakterisierung der Glycosyltransferase Sace_3599 aus Saccharopolyspora erythraea NRRL2338

Abstract: Sace_3599 ist eine natürlich vorkommende Glycosyltransferase (GT) des Erythromycin-Produzenten Saccharopolyspora erythraea NRRL2338. GTn sind wichtige Enzyme, die sowohl in Eukaryoten als auch in Prokaryoten vorkommen und biotechnologisch häufig zur Erzeugung neuer Naturstoffe verwendet werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde Sace_3599 näher erforscht und charakterisiert.
HPLC/ESI-MS-Analysen der Rohextrakte von in vitro Aktivitätsassays zeigten, dass die durch Sace_3599 katalysierte Glucosylierungsreaktion bevorzugt bei 28 °C und einem hohen pH-Wert (pH 8,8) stattfindet. Als Zuckerdonor bevorzugte Sace_3599 Uridindiphosphat (UDP)-α-D-Glucose. Es konnte außerdem gezeigt werden, dass Sace_3599 sowohl N- als auch O-Glucosylierungen katalysiert. Wurde als Substrat 1,4-Diaminoanthrachinon (U3) eingesetzt, so entstanden sowohl das Monoglucosid N1-glucosyl-1,4-diaminoanthrachinon (U3G) als auch das Diglucosid N1,N4-diglucosyl-1,4-diaminoanthrachinon (U3DG). Wurde 1,4-Dihydroxyanthrachinon (U2) verwendet, so wurden O1-glucosyl-1,4-dihydroxyanthrachinon (U2G) und O1,O4-diglucosyl-1,4-dihydroxyanthrachinon (U2DG) als Produkte detektiert.
Die CAZy-Datenbank (http://www.cazy.org/) beschreibt Sace_3599 aufgrund von Sequenzanalysen als invertierende GT der GT-B-Superfamilie (Lombard et al., 2014). Diese Zuordnung konnte im Rahmen der vorliegenden Arbeit experimentell bestätigt werden. Sace_3599 benötigte kein divalentes Kation als Cofaktor und mit UDP-α-D-Glucose als Zuckerdonor enstand in vitro ausschließlich das β-Monoglucosid.
Durch in vitro Assays mit radioaktiv markierter UDP-(14C)Glucose konnte gezeigt werden, dass Sace_3599 neben Glycosyltransferase- auch Glycohydrolase-Aktivität besitzt.
Sowohl in silico- als auch in vitro-Analysen und in vivo Biotransformationsexperimente veranschaulichten die Ähnlichkeit von Sace_3599 zu der Makrolid-GT OleI aus Streptomyces antibioticus. Aktivitätsassays und Hemmhoftests zeigten, dass Sace_3599, wie auch OleI, an der Resistenzvermittlung gegen Makrolid-Antibiotika beteiligt ist. Nach Biotransformationsexperimenten mit U3 und den Actinomyceten-Stämmen S. albus Gluc x pUWL-A-sace_3599 und S. albus Gluc x pUWL-A-oleI konnten aus den Rohextrakten α- und β-Monoglucoside sowie Diglucoside als Produkte gereinigt werden. Wie es zu der Entstehung beider Anomere kommt, konnte trotz diverser Experimente noch nicht abschließend geklärt werden

Object Details

• Location: Deutsche Nationalbibliothek Frankfurt am Main
• Extent: Online-Ressource
• Language: Deutsch
• Notes: Universität Freiburg, Dissertation, 2020

Classification and Topics

• Keyword: Holztafel ; Dämmplatte ; Tausendgüldenkraut ; Hydroxybenzoat-CoA-Ligase ; Mutante ; Holzfaserwerkstoff ; Herstellung ; Isolierung ; NMR-Spektroskopie ; Escherichia coli ; Zellkultur ; Biosynthese ; Glycosyltransferasen ; Actinomycetaceae ; Saccharopolyspora erythraea ; Glykosylierung ; Biotransformation ; Enzymkatalyse

Contributors, Places and Time

• Event: Veröffentlichung
• (where): Freiburg
• (who): Universität
• (when): 2020
• Creator: Gutacker, Fabienne
• Contributor: Bechthold, Andreas ; Albert-Ludwigs-Universität Freiburg. Fakultät für Chemie und Pharmazie

Further information

• DOI: 10.6094/UNIFR/167825
• URN: urn:nbn:de:bsz:25-freidok-1678254
• Rights: Der Zugriff auf das Objekt ist unbeschränkt möglich.
• Last update: 15.08.2025, 7:34 AM CEST