Multi-component surfactants stabilizing therapeutic proteins - a thermodynamic approach

Abstract: Surfactants are frequently used excipients in liquid pharmaceutical formulations of biological drugs, mainly proteins. Polysorbates (PS), for example, are able to stabilize the protein’s native state, thus providing enough stability to ensure an appropriate shelf-life. Further, PS are applied to, for example, solubilize poorly water soluble drugs and emulsify liquids. A special feature is their approval for parenteral applications, such as intravenous injections. Only a very limited number of surfactants is approved for this purpose. Therefore, PS are highly relevant for the pharmaceutical industry.
The European Pharmacopeia defines PS as broad mixtures of molecules with a huge diversity of properties. PS molecules basically consist of a sorbitan ring that is connected to up to four ethylene oxide chains of different lengths. One or more can be esterified with fatty acids of variable chain lengths and saturation degrees. Consequently, PS can be mono-, di-, tri-, and tetra-esters with varying alkyl chain lengths for each ester position and isomers of these. On top of that, they can include isosorbides that are functionalized with ethylene oxide and acyl chains. PS20 contains mainly lauryl chains, and PS80 predominantly oleyl chains. This immense variety of structures makes it impossible to define their characteristics, such as critical micelle concentration (CMC) and cloud point (TCP) in the same way as for single-component surfactants. Published literature values often lack the consideration of a complex mixture of molecules and should be treated with caution.
To characterize the CMC or rather the complex association behavior precisely, a series of demicellization experiments of isothermal titration calorimetry (ITC) with different concentrations of PS was performed and evaluated. The evaluation included the development of a proper model to describe the association behavior. The experiment-dependent heats of titration were transformed into a common function of the state of a sample, the micellar enthalpy Qm(c). With the help of Qm(c), it was found that initial micelles already exist below the lowest investigated concentrations and that micellization and the change of micelle properties continue at least up to concentrations of 10 mM PS. Further, the TCP of different concentrations of PS was determined. It was found to increase with increasing concentration of PS20, but to decrease with increasing concentration of PS80. With this knowledge, a phase diagram of the micelle formation of both PS was generated. The model developed in this work to explain the micellization behavior of PS contributed to the revelation of the TCP properties.
Since the main properties of PS were resolved, their application in pharmaceutical protein formulations came into focus. Four different mechanisms to prevent instabilities of proteins are stated in literature: direct binding, preferential exclusion, coverage of interfaces and surface and chaperone-effects. First, the mechanisms of direct binding and preferential exclusion were accurately investigated with different calorimetric approaches. The considerations led to the conclusion that direct binding as well as preferential exclusion only play minor roles but cannot completely be ruled out. Further, the coverage of interfaces and surface were observed more closely. To investigate this mechanism, proteins were exposed to shaking stress and their condition was checked with DSC measurements afterwards. So far, this has been investigated quantitatively with fluorescence or immunoassays and qualitatively with light scattering. These methods require a high level of equipment or markers that could influence the measurements. The application of DSC for this purpose is innovative and it was attempted to draw quantitative conclusions on the condition of a protein based on the change in the thermodynamic properties. Unfortunately, the approach did not yet yield meaningful outcomes but provided a new perspective. With some further time investment, the development of a conclusive DSC procedure is realizable.
All in all, the better understanding of PS, their properties and functional mechanisms yielded fundamental advances for the application in pharmaceutical formulations
Abstract: Tenside sind häufig verwendete Zusätze für flüssige pharmazeutische Formulierungen von biologischen Arzneistoffen, hauptsächlich Proteinen. Polysorbate (PS) gehören zur Gruppe der Tenside und sind dazu in der Lage, den nativen Zustand eines Proteins zu stabilisieren und dadurch eine angemessene Lagerstabilität zu gewährleisten. Darüber hinaus werden PS z.B. zur Solubilisierung schlecht wasserlöslicher Arzneistoffe und zur Emulgierung von Flüssigkeiten eingesetzt. Ein besonderes Merkmal ist ihre Zulassung für parenterale Anwendungen, wie z.B. intravenöse Injektionen. Nur eine sehr begrenzte Anzahl von Tensiden ist für diesen Zweck zugelassen. Daher haben PS eine große Wichtigkeit für die pharmazeutische Industrie.
Das Europäische Arzneibuch definiert PS als breit gefächerte Mischungen von Molekülen mit einer großen Vielfalt an Eigenschaften. PS-Moleküle bestehen im Wesentlichen aus einem Sorbitanring, welcher mit bis zu vier Ethylenoxidketten unterschiedlicher Länge verknüpft sein kann. Eine oder mehrere dieser Ketten können mit Fettsäuren verschiedener Kettenlängen und Sättigung verestert sein. Demzufolge können PS Mono-, Di-, Tri- oder Tetra-Ester mit unterschiedlichen Alkylkettenlängen für jede Ester-Position, und Isomere davon, sein. Zudem können sie Isosorbide enthalten, die mit Ethylenoxid und Acylketten versehen sind. PS20 enthält hauptsächlich Laurylketten, PS80 überwiegend Oleylketten. Diese große Strukturvielfalt macht es unmöglich, die Eigenschaften der PS, wie die kritische Mizellbildungskonzentration (CMC) und den Trübungspunkt (TCP), so einfach wie für Ein-Komponenten-Systeme zu definieren. Bisher veröffentlichten Literaturwerten mangelt es an der Berücksichtigung dieser Vielfalt und daher sollten diese mit Vorsicht betrachtet werden.
Um die CMC, bzw. das komplexe Assoziationsverhalten, genau zu charakterisieren, wurde eine Reihe von Demizellisierungsexperimenten verschiedener PS-Konzentrationen mit isothermer Titrationskalorimetrie (ITC) durchgeführt und ausgewertet. Dabei wurde ein geeignetes Modell zur Beschreibung des Assoziationsverhaltens entwickelt. Die vom jeweiligen Experiment abhängigen Reaktionswärmen wurden in eine allgemeine Funktion des Zustands einer Probe, die mizellare Enthalpie Qm(c), umgewandelt. Mithilfe von Qm(c) wurde festgestellt, dass bereits unterhalb der niedrigsten untersuchten Konzentrationen Mizellen existieren und die Mizellbildung und Veränderung der Eigenschaften bis zu Konzentrationen von mindestens 10 mM anhalten. Außerdem konnte der TCP verschiedener PS-Konzentrationen bestimmt werden. Es wurde festgestellt, dass er mit zunehmender Konzentration von PS20 steigt, mit zunehmender Konzentration von PS80 jedoch abnimmt. Mit diesem Wissen wurde ein Phasendiagramm für die Mizellbildung beider PS erstellt. Das in dieser Arbeit entwickelte Modell zur Erklärung der Mizellbildung von PS konnte auch zur Aufklärung der TCP-Eigenschaften beitragen.
Nachdem die wichtigsten Eigenschaften der PS aufgeklärt waren, rückte ihre Anwendung in der pharmazeutischen Formulierung von Proteinen in den Mittelpunkt der Untersuchungen. In der Literatur werden vier verschiedene Mechanismen zur Vorbeugung von Instabilitäten von Proteinen beschrieben: direkte Bindung, preferential exclusion, Grenz- und Oberflächenaktivität sowie Chaperon-Effekte. Zunächst wurden direkte Bindung und preferential exclusion mit verschiedenen, kalorimetrischen Methoden genau untersucht. Die Ergebnisse führten zu der Schlussfolgerung, dass sowohl direkte Bindung als auch preferential exclusion nur eine untergeordnete Rolle spielen, aber nicht völlig ausgeschlossen werden können. Im Weiteren wurde die Grenz- und Oberflächenaktivität näher betrachtet. Um diesen Mechanismus im Detail zu erforschen, wurden die Proteine einer Beanspruchung durch Schütteln ausgesetzt und anschließend ihr Zustand mit DSC-Messungen überprüft. Bisher wurde dieser vor allem mit Fluoreszenz- oder Immunassays quantitativ und mit Lichtstreuung qualitativ untersucht. Diese Methoden erfordern einen hohen apparativen Aufwand oder benötigen Marker, die die Messungen beeinflussen könnten. Die Anwendung der DSC ist hierfür neuartig und es wurde basierend auf der Veränderung thermodynamischer Eigenschaften versucht, quantitative Rückschlüsse auf den Zustand des Proteins zu ziehen. Leider erbrachte der Ansatz bisher noch keine aussagekräftigen Ergebnisse, allerdings konnte er neue Perspektiven eröffnen. Mit etwas Zeitaufwand ist die Entwicklung einer schlüssigen DSC-Methode realisierbar.
Insgesamt führte das bessere Verständnis von PS, ihren Eigenschaften und Funktionsmechanismen zu grundlegenden Fortschritten für die Anwendung in pharmazeutischen Formulierungen

Object Details

• Location: Deutsche Nationalbibliothek Frankfurt am Main
• Extent: Online-Ressource
• Language: Englisch
• Notes: Universität Freiburg, Dissertation, 2021

Classification and Topics

• Keyword: Detergentien ; Keramischer Verbundwerkstoff ; Proteine ; Stabilisierung ; Kalorimetrie ; Polysorbate ; Antikörper ; Dynamische Lichtstreuung

Contributors, Places and Time

• Event: Veröffentlichung
• (where): Freiburg
• (who): Universität
• (when): 2022
• Creator: Knoch, Hannah Simona
• Contributor: Heerklotz, Heiko ; Massing, Ulrich ; Albert-Ludwigs-Universität Freiburg. Lehrstuhl für Pharmazeutische Technologie und Biopharmazie ; Albert-Ludwigs-Universität Freiburg. Fakultät für Chemie und Pharmazie

Further information

• DOI: 10.6094/UNIFR/223578
• URN: urn:nbn:de:bsz:25-freidok-2235783
• Rights: Open Access; Der Zugriff auf das Objekt ist unbeschränkt möglich.
• Last update: 25.03.2025, 1:46 PM CET