Exploring Sirtuin 2: From the development of chemical tools to the identification of new substrates

Abstract: Sirtuins are NAD+-dependent enzymes comprising seven human isotypes (Sirt1-7) that regulate a variety of biological pathways. They catalyze the deacetylation of lysine residues of histone and non-histone proteins, and are classified as class III histone deacetylases (HDACs). In addition to deacetylation, Sirt2 can also catalyze the removal of long-chain fatty acyl groups such as myristoyl and palmitoyl. Sirt2 influences many cellular pathways and its dysregulation has been associated with the pathogenesis of different diseases including cancer. Hence, selective and potent inhibitors of Sirt2 are needed to further study its (patho)physiological role and evaluate Sirt2 as a potential target for pharmaceutical treatment.

In this work, a set of new Sirtuin-Rearranging ligand (SirReal)-based Sirt2 inhibitors was characterized in vitro and in cells. The in vitro characterization confirmed high affinity and Sirt2 selectivity of the new compounds over other class I sirtuins and HDACs. A subset of the inhibitors, containing a triazole ring, was identified as simultaneous inhibitors of Sirt2 deacetylase and defatty-acylase activity. In all in vitro assays, a morpholine derivative (12) was the most potent compound of the tested inhibitors, which could be rationalized with docking studies.
Due to the lack of a suitable method to examine cellular target engagement of Sirt2 inhibitors, a NanoBRET assay was developed as new tool for the field of Sirt2 inhibitor development to directly study cellular Sirt2 binding in a straightforward and efficient manner. In addition to the Sirt2 inhibitors characterized in this work, a selection of published Sirt2 inhibitors was tested in the assay confirming its suitability to detect cellular target engagement of Sirt2 inhibitors with different scaffolds.
In phenotypic and functional assays, the Sirt2 inhibitors reduced levels of the oncoprotein c Myc and blocked cell migration in metastatic androgen-independent prostate cancer cells. These effects were most pronounced for 12, which could be confirmed as a simultaneous inhibitor of Sirt2-catalzyed defatty-acylation and deacetylation in cells. Hence, the obtained results suggest that simultaneous inhibition of both Sirt2 activities leads to increased anticancer effects.
Finally, the neuronal calcium sensor 1 (NCS1) protein was discovered as a potential new substrate of Sirt2-mediated defatty-acylation by confirming the conversion of a myristoylated NCS1 peptide in vitro and revealing reduced levels of fatty-acylated NCS1 upon overexpression of Sirt2 in a newly established assay for the detection of protein fatty acylation levels
Abstract: Sirtuine sind NAD+-abhängige Enzyme mit sieben verschiedenen humanen Isotypen, die an der Regulation zahlreicher zellulärer Signalwege beteiligt sind. Sie katalysieren die Desacetylierung von Histonen und Nicht-Histon-Proteinen und werden als Histondesacetylasen (HDACs) der Klasse III beschrieben. Neben der Desacetylierung von Lysinen kann Sirt2 auch längerkettige Fettsäurereste abspalten (Desacylierung). Sirt2 beeinflusst zahlreiche zelluläre Funktionen und eine Fehlregulierung von Sirt2 wurde bereits mit zahlreichen Erkrankungen wie Krebs in Verbindung gebracht. Deshalb sind selektive und wirksame Hemmstoffe für Sirt2 von großer Bedeutung, um dessen physiologische Rolle genauer untersuchen und Sirt2 als Angriffspunkt für die Behandlung von Krankheiten nutzen zu können.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine neue Generation der „Sirtuin-Rearranging Ligands“ (SirReals) als Sirt2-Hemmstoffe in-vitro und in Zellen charakterisiert. Die In-vitro-Charakterisierung bestätigte eine hohe Affinität und Sirt2-Selektivität der neuen Hemmstoffe. Außerdem zeigten die Hemmstoffe, die einen Triazolring enthalten, eine gleichzeitige Hemmung der Sirt2-katalysierten Desacetylierung und Desacylierung. Der Hemmstoff 12, ein Morpholinderivat, zeigte in allen in-vitro-Testsystemen den stärksten Effekt, was mithilfe von Dockingstudien erklärt werden konnte.
Da bisher keine guten Methoden zur Untersuchung der zellulären Target-Bindung von Sirt2- Hemmstoffen vorhanden waren, wurde ein NanoBRET-Assay als neue Methode für die Sirt2-Hemmstofftestung entwickelt. Zusätzlich zu den Hemmstoffen dieser Arbeit wurden bereits publizierte Sirt2-Hemmstoffe untersucht, wodurch bestätigt werden konnte, dass sich der entwickelte Assay ebenfalls zur Testung strukturell unterschiedlicher Hemmstoffe eignet.
In phänotypischen und funktionellen zellulären Untersuchungen führte die Behandlung mit den Sirt2-Inhibitoren zu gesenkten Leveln des Onkoproteins c-Myc und einer reduzierten Migration von metastasierenden, androgen-unabhängigen Prostatakrebszellen. Diese Effekte waren am stärksten bei Hemmstoff 12 ausgeprägt, welcher außerdem eine simultane Hemmung der Sirt2-katalysierten Desacetylierung und Desacylierung in Zellen zeigte. Dies lässt darauf schließen, dass die gleichzeitige Hemmung beider Sirt2-Aktivitäten möglicherweise zu einer gesteigerten krebshemmenden Wirkung führt.
Zusätzlich wurde der neuronale Calciumsensor 1 (NCS1) als potenziell neues Substrat von Sirt2 identifiziert, da die Umsetzung eines myristoylierten NCS1-Peptids durch Sirt2 in-vitro gezeigt werden konnte und eine Überexpression von Sirt2 zu reduzierten Spiegeln des Fettsäure-modifizierten NCS1-Proteins führte

Object Details

• Location: Deutsche Nationalbibliothek Frankfurt am Main
• Extent: Online-Ressource
• Language: Englisch
• Notes: Universität Freiburg, Dissertation, 2022

Classification and Topics

• Keyword: Sirtuine ; Epigenetik ; Inhibitor

Contributors, Places and Time

• Event: Veröffentlichung
• (where): Freiburg
• (who): Universität
• (when): 2022
• Creator: Vogelmann, Anja
• Contributor: Jung, Manfred ; Lönarz, Christoph ; Albert-Ludwigs-Universität Freiburg. Institut für Pharmazeutische Wissenschaften ; Albert-Ludwigs-Universität Freiburg. Fakultät für Chemie und Pharmazie

Further information

• DOI: 10.6094/UNIFR/230081
• URN: urn:nbn:de:bsz:25-freidok-2300813
• Rights: Open Access; Der Zugriff auf das Objekt ist unbeschränkt möglich.
• Last update: 14.08.2025, 10:56 AM CEST