Zielgerichtete Inhibition der Lysin-spezifischen Demethylase 1 (LSD1) mittels Nitroreduktase-Prodrugs

Abstract: Die Lysin-spezifische Demethylase 1 (LSD1) ist über die Demethylierung von Lysin-4 und Lysin-9 in Histon-3 an der Regulation der Genexpression beteiligt und damit Teil der Epigenetik. Außerdem ist LSD1 in Protein-Komplexen gebunden, in denen LSD1 auch nicht-katalytische Funktionen hat. In diversen Krebszellen werden erhöhte LSD1-Level beobachtet, sodass LSD1-Inhibitoren potentielle Wirkstoffe darstellen. Für das Ziel dieser Arbeit, die zielgerichtete Inhibition von LSD1, wurden Nitroreduktase (NTR)-aktivierbare Prodrugs von LSD1-Inhibitoren in den AML-Zelllinien THP1wt und THP1NTR in phänotypischen und funktionellen Assays getestet. Die biologisch möglichst inaktiven Prodrugs werden von der NTR zu den aktiven LSD1-Inhibitoren aktiviert. Neben dem LSD1-Inhibitor werden durch die Prodrug-Aktivierung Michael-Akzeptoren als Nebenprodukt frei, deren Reaktivitäten in zellulären Assays untersucht wurden. Aus den Ergebnissen aller Assays wurden drei Prodrugs des nanomolar potenten LSD1-Inhibitors OG86 (2a) mit den Prodrug-Resten 4-Nitrobenzyl (2b), 2-Fluor-4-nitrobenzyl (2c) und 1-Methyl-2-nitroimidazol-5-yl-methyl (2f) mit bedeutend geringerer Potenz in THP1wt-Zellen im Vergleich zum Inhibitor und deutlichem Aktivitätsfenstern zwischen den Zelllinien THP1wt und THP1NTR identifiziert. Diese Zelltyp-spezifischen Effekte konnten in Mikroarray-Experimenten mit Prodrug 2f bestätigt werden. Überdies wurden Gene von Proteinen mit verändertem Expressionslevel nach LSD1-Inhibition identifiziert, welche zu erhöhten zytosolischen Calcium-Konzentrationen führen könnten. Erhöhte Calcium-Konzentrationen können zu den in Metabolom-Experimenten beobachteten reduzierten Leveln an PC-Metaboliten in THP1wt-Zellen nach LSD1-Inhibition führen.
Weiterführend wurden Experimente für eine Locus-spezifische LSD1-Inhibition mittels dCas9-Targeting der NTR durchgeführt. Nach der erfolgreichen Klonierung von Plasmiden, welche für das Fusionsprotein dCas9NTR codieren, konnte ein rekombinantes dCas9NTR-Protein gewonnen werden und dessen katalytische Aktivität in einem NTR-Assay verifiziert werden. Erste Ergebnisse zur Expression des dCas9ntr-Gens unter der Kontrolle des induzierbaren Tre-Promotor in der neuen Zelllinie THP1dCas9NTR und Vorschläge für potentielle sgRNAs werden ausführlich diskutiert. Zusammen mit den Assay-Ergebnissen der THP1dCas9NTR-Zelllinie mit dem Prodrugs 2f wurden wichtige, grundlegende Ergebnisse für die erfolgreiche Etablierung eines dCas9-Targeting Systems der NTR für eine Locus-spezifische LSD1-Inhibition erzielt
Abstract: The lysine-specific demethylase 1 (LSD1) is involved in the regulation of gene expression via the demethylation of lysine-4 and lysine-9 in histone-3, and hence impacts epigenetic mechanisms. Additionally, LSD1 has non-catalytic functions in different protein complexes. Several cancer cells show increased levels of LSD1, why LSD1 inhibitors are potential active incredients for treatments. For the scope of this work, a targeted inhibition of LSD1, several nitroreductase (NTR)-prodrugs of LSD1 inhibitors and negative controls have been tested in phenotypic and functional assays with the two cell lines THP1wt and THP1NTR. The biologic inactive prodrugs are activated by the NTR, releasing the active LSD1 inhibitors. Besides the inhibitor, also a Michael acceptor is released as side product from prodrug activation. Reactivities of these Michael acceptors have also been investigated in cellular assays. The results of all assays revealed the three prodrugs of the nanomolar potent LSD1 inhibitor OG86 (2a) with 4-nitrobenzyl (2b), 2-fluor-4-nitrobenzyl (2c) and 1-methyl-2-nitroimidazol-5-yl-methyl (2f) as the nitroaromatic prodrug moiety, with significant reduced activity in THP1wt cells compaired to the inhibitor and a substantial activity window between the two cell lines THP1wt and THP1NTR. These cell-type specific effects have been verified with microarray experiments and prodrug 2f in THP1NTR versus THP1wt cells. Besides this, affected genes from LSD1 inhibition in THP1wt cells have been identified, which can lead to increased cytosolic calcium concentrations. Increased calcium concentrations can result in the observed changes of PC-metabolite levels in metabolome experiments with THP1wt cells after LSD1 inhibition.
Furthermore, experiments towards a dCas9-targeting system of the NTR to realize locus-specific inhibition of LSD1 have been performed. After the successful cloning of plasmids, coding for the fusion protein dCas9NTR, a recombinant dCas9NTR protein was obtained. The enzymatic activity of the NTR in this fusionprotein could be verified in an activity assay. First results on the expression of the dcas9ntr gene under the control of the inducible tre-promotor in the new THP1dCas9NTR cell line, together with proposed sgRNA-sequences, are discussed in detail. Altogether, with the assay-results of prodrug 2f in the THP1dCas9NTR cell line, major fundamental results for the successful establishment of a dCas9-targeting systems for locus-specific LSD1-inhibition have been obtained

Angaben zum Objekt

• Standort: Deutsche Nationalbibliothek Frankfurt am Main
• Umfang: Online-Ressource
• Sprache: Deutsch
• Anmerkungen: Universität Freiburg, Dissertation, 2020

Klassifikation und Themen

• Schlagwort: Targeting Cancer (2015 : Cold Spring Harbor, NY), Veranstaltung ; Epigenetik ; Methoxybenzoat-Monooxygenase ; Inhibition ; Lysin ; Zelle ; Epigenetik ; Pro-Pharmakon ; Akute myeloische Leukämie ; CRISPR/Cas-Methode ; Zellkultur

Beteiligte, Orts- und Zeitangaben

• Ereignis: Veröffentlichung
• (wo): Freiburg
• (wer): Universität
• (wann): 2020
• Urheber: Hau, Mirjam
• Beteiligte Personen und Organisationen: Jung, Manfred ; Albert-Ludwigs-Universität Freiburg. Fakultät für Chemie und Pharmazie

Weitere Informationen

• DOI: 10.6094/UNIFR/167799
• URN: urn:nbn:de:bsz:25-freidok-1677995
• Rechteinformation: Der Zugriff auf das Objekt ist unbeschränkt möglich.
• Letzte Aktualisierung: 15.08.2025, 07:34 MESZ