Untersuchungen von Bienen auf Streptomyceten und deren produzierten Naturstoffe

Abstract: Streptomyceten sind eine wichtige Quelle vieler Naturstoffe, die als Therapeutikum bei der Behandlung schwerwiegender Erkrankungen eingesetzt werden. Bekannten Quellen für Streptomyceten, wie der Boden oder das Meer, sind jedoch nahezu erschöpft und neue Naturstoffe werden nur noch selten gefunden. Auf der Suche nach neuen ergiebigen Quellen sind Insekten in den letzten Jahren verstärkt in den Fokus von Forschungen geraten.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden westliche Honigbienen (Apis mellifera) und dunkle Erdhummeln (Bombus terrestris) auf eine symbiontische Beziehung mit Aktinomyceten, insbesondere Streptomyceten untersucht. Hierfür wurde eine Methode etabliert, mit der Streptomyceten sowohl aus dem Inneren als auch von der Außenseite von Bienen isoliert werden können. Es wurden über 150 Isolate mit einer Streptomyceten-ähnlichen Morphologie isoliert, die anhand unterschiedlicher Sequenzen, wie der 16S rDNA, der Gyrase B oder zufälligen Fragmente der kompletten DNA bestimmt und klassifiziert wurden. Von insgesamt 117 Stämmen wurde die 16S rDNA-Sequenz bestimmt. Zur Verifizierung der gebildeten Gruppen wurden von 73 repräsentativen Stämmen zusätzlich die gyrB-Sequenz bestimmt. Basierend auf den generierten Daten wurden für die Honigbienen zehn verschiedene Streptomyceten identifiziert. Für die Erdhummeln wurden sieben unterschiedliche Streptomyceten gefunden.
Mit den honigbienenassoziierten Streptomyceten AM2-1-1, AM2-3-1, AM3-1-1, AM4-1-1 und AM8-1-1 sowie dem hummelassoziierten Streptomyceten BB1-1-1 wurden anschließend sechs vielversprechende Kandidaten für eine Sequenzierung des vollständigen Genoms ausgewählt. Für alle Stämme wurden mögliche Biosynthesegencluster detektiert, wodurch ein großes Potential für die Produktion von neuen Naturstoffen festgestellt wurde. Drei dieser Genome wurden unter Anwendung einer Vielzahl unterschiedlicher Analysewerkzeuge bearbeitet. Dadurch konnte einerseits die genetische Ausstattung der isolierten Streptomyceten beschrieben werden, andererseits wurden Stoffwechselwege und Protein-Protein Interaktionen analysiert. Durch den Vergleich der Aminosäuresequenzen mit bodenassoziierten Streptomyceten wurde gezeigt, dass bienenassoziierte Streptomyceten nur eine geringe Homologie zu den gewählten Referenzstämmen aufweisen.
Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit lag in der Beschreibung der produzierten Naturstoffe. Von dem bienenassoziierten Streptomyceten AM2-1-1 konnten zwei Substanzen isoliert werden. Die als AB3 bezeichnete Substanz ist ein neues Griseoluteinsäure-Derivat mit einer Phenazin-Grundstruktur und weist eine Isobutyratseitenkette, wie sie zuvor noch nicht beschrieben wurde. Ebenfalls wurde für die Biosynthese von AB3 ein Cluster identifiziert, dass 95 % Übereinstimmung zu dem Biosynthesegencluster von Griseoluteinsäure von S. griseoluteus hat. Eine weitere Struktur, die ebenfalls aus AM2-1-1 isoliert werden konnte, ist Phenylessigsäure. Aus AM4-1-1 konnte mit AB5 eine Substanz isoliert werden, die bislang noch nicht als Naturstoff beschrieben wurde. Es handelt sich dabei um ein Biaryl mit einem Methoxazolring. Die Biosynthese dieser Substanz ist bislang unklar. Basierend auf den Genomdaten und den detektieren Biosynthesegencluster konnte jedoch ein Vorschlag für ein mögliches Cluster gemacht werden.
Zudem wurde die Aktivierung stiller Gencluster unter Anwendung des OSMAC-Ansatzes für die isolierten bienenassoziierten Stämmen untersucht. Dazu wurde ein umfassendes Screening durchgeführt, um zum einen die Auswirkungen verschiedener Kultivierungsbedingungen auf das Sekundärmetabolitprofil zu untersuchen, aber auch den Einfluss von Co-Kultiverungspartner wie E. coli, B. subtilis oder anderen bienenassoziierten Streptomyceten. Den OSMAC-Ansatz erweiternd wurde der Einfluss des bldA-Gens auf den Sekundärmetabolismus und die Morphologie der sechs bienenassoziierten Streptomyceten untersucht. Das Genprodukt von bldA ist eine tRNA, die das seltene UUA-Codon in die Aminosäure Leucin translatieren kann. Durch die konstitutive Expression dieses Regulators konnte bei drei der sechs bienenassoziierten Streptomyceten eine Änderung im Produktionsprofil festgestellt werden. Auch wurde bei einem Stamm eine Veränderung der Morphologie beobachtet.
Durch eine systematische Analyse von Bienen konnten diese als eine vielversprechende Quelle neuer Streptomyceten identifiziert werden. Diese Streptomyceten sind in der Lage potenziell neue und interessante Naturstoffe zu produzieren. Erweitert wird dieses Potential durch das Verfolgen verschiedene Strategien zur Aktivierung stiller Gencluster
Abstract: Streptomyces are an important source of many natural substances which are often used as therapeutic agents in treatment of serious diseases. However, known sources of Streptomyces such as soil or the sea are almost exhausted and new natural products are rarely found. In the search for new, productive sources, insects have increasingly become the focus of research in recent years.
In this study, western honeybees (Apis mellifera) and dark bumblebees (Bombus terrestris) were analyzed for a symbiotic relationship with actinomycetes, in particular Streptomyces. For this purpose, a method was established with which Streptomyces can be isolated from both the inside and the outside of bees. More than 150 isolates with a Streptomyces-like morphology were isolated, which were determined and classified using different sequences, such as 16S rDNA, gyrase B or random fragments of the complete DNA. The 16S rDNA sequences was determined for 117 strains. To verify the groups formed the gyrB sequence of 73 representative strains was also determined. Based on the data generated, ten different Streptomyces were identified for the honeybees. Seven Streptomyces were found for the bumblebees.
With the honeybee-associated Streptomyces AM2-1-1, AM2-3-1, AM3-1-1, AM4-1-1 and AM8-1-1 as well as the bumblebee-associated Streptomyces BB1-1-1, six promising candidates were then selected for whole genome sequencing. Possible biosynthetic gene clusters were detected for all strains, indicating great potential to produce new natural products. Three of these genomes were analyzed using a variety of different tools. This enabled the genetic make-up of the isolated Streptomyces to be described and metabolic pathways and protein-protein interactions to be analyzed. By comparing the amino acid sequences with soil-associated Streptomyces, it was shown that bee-associated Streptomyces only have a low homology to the selected reference strains.
An additional focus of this work was the description of the natural products which were produced. Two substances were isolated from the bee associated Streptomyces sp. AM2-1-1. The substance which is called AB3 is a new griseoluteic acid derivative with a phenazine basic structure and an isobutyrate side chain, that has not been described before. A biosynthesis cluster was also identified for the biosynthesis of AB3 that has 95 % similarity to the biosynthetic gene cluster of griseoluteic acid from S. griseoluteus. Another structure isolated from AM2-1-1 is phenylacetic acid. AB5, a substance that has not yet been described as a natural product, was isolated from AM4-1-1. It is a Biaryl with a Methoxazol ring. The biosynthesis of this substance has not been elucidated yet. However, on basis of the genome data and the detected biosynthetic gene cluster, a suggestion for a possible cluster was made.
In addition, the activation of silent gene cluster was analyzed using the OSMAC approach for the isolated bee-associated strains. For this purpose, a comprehensive screening was carried out to investigate the effects of different cultivation conditions on the secondary metabolite profile as well as the influence of co-cultivation partners such as E. coli, B. subtilis and other bee-associated Streptomyces. Expanding the OSMAC approach, the influence of the bldA-gene on the secondary metabolism and morphology of the six bee-associated Streptomyces was investigated. The gene product of bldA is a tRNA that can translate the rare UUA codon into the amino acid leucine. Constitutive expression of this regulator led to a change in the production profile of three of the six bee-associated Streptomyces. A change in morphology was also observed in one strain.
A systematic analysis of bees identified them as a promising source of new Streptomyces capable of producing potential new natural products. This potential is enhanced by pursuing different strategies to activate silent gene cluster

Angaben zum Objekt

• Standort: Deutsche Nationalbibliothek Frankfurt am Main
• Umfang: Online-Ressource
• Sprache: Deutsch
• Anmerkungen: Universität Freiburg, Dissertation, 2024

Klassifikation und Themen

• Schlagwort: Escherichia coli ; Streptomycetaceae ; Naturstoff ; Streptomycetaceae ; Bienen ; Insekten ; Biene ; Erdhummel ; Naturstoff

Beteiligte, Orts- und Zeitangaben

• Ereignis: Veröffentlichung
• (wo): Freiburg
• (wer): Universität
• (wann): 2024
• Urheber: Bergfeld, Arne
• Beteiligte Personen und Organisationen: Bechthold, Andreas ; Bechthold, Andreas ; Layer, Gunhild ; Albert-Ludwigs-Universität Freiburg. Fakultät für Chemie und Pharmazie

Weitere Informationen

• DOI: 10.6094/UNIFR/255195
• URN: urn:nbn:de:bsz:25-freidok-2551953
• Rechteinformation: Open Access; Der Zugriff auf das Objekt ist unbeschränkt möglich.
• Letzte Aktualisierung: 25.03.2025, 13:56 MEZ