Charakterisierung der Struktur, Spezifität und Funktion von Yersinia enterocolitica- und Yersinia kristensenii-Glykosyltransferasen

Abstract: In der vorliegenden Arbeit wurden Aktivität, Substratspezifität und Funktion der Glykosyltransferasen YkGT aus dem Mauspathogen Yersinia kristensenii und YeGT aus dem Zoonose-Erreger Yersinia enterocolitica charakterisiert. YkGT und YeGT wurden durch Sequenzvergleiche mit den Glykosyltransferasedomänen von PaTox, einem Toxin aus dem human- und insektenpathogenen Keim Photorhabdus asymbiotica, und dem Effektor Afp18 aus dem Fischpathogen Yersinia ruckeri entdeckt. YkGT (313 Aminosäuren) und YeGT (297 Aminosäuren) sind nach Sequenzierungsdaten des „National Center for Biotechnology Information“ (NCBI) als eigenständige Proteine in den entsprechenden Genomen annotiert worden und gelten als bisher kleinste bekannte Glykosyltransferasen mit einer Aminosäureidentität von 96 %.
Die Gene beider Proteine wurden in Expressionsvektoren kloniert, rekombinant in E. coli exprimiert und durch Affinitätschromatographie isoliert. Die rekombinanten Proteine wurden anschließend biochemisch und zellbiologisch charakterisiert. Diese Untersuchungen zeigen, dass beide Proteine Glykohydrolaseaktivität besitzen und UDP-N-Acetylglukosamin (UDP-GlcNAc) hydrolysieren. In Lysaten von HeLa-Zellen übertragen die beiden Enzyme UDP-GlcNAc auf ca. 25 kDa große Proteine, die als Rho-Proteine identifiziert wurden. Trotz der hohen Sequenzidentität von YkGT und YeGT unterscheidet sich das Akzeptorsubstratspektrum der Glykosyltransferasen erheblich. Das bevorzugte Akzeptorsubstrat beider Glykosyltransferasen ist jedoch RhoA. Es konnte gezeigt werden, dass YkGT und YeGT RhoA an Tyrosin 34 (Rac1 und Cdc42 in Tyrosin 32), das in der sog. Switch I-Region lokalisiert ist, modifizieren. Die Glykosylierung des Tyrosin-Restes in Rho-Proteinen hemmt den Nukleotidaustausch der GTP-bindenden Proteine durch Guanine nucleotide exchange factors (GEFs) und beeinflusst die Interaktion der GTP-beladenen, aktiven Rho-Proteine mit Effektor-Proteinen wie Rhotekin (bei RhoA) und p21-aktivierter Proteinkinase PAK (bei Rac1 und Cdc42).
YkGT und YeGT sind beide nicht membrangängig. Auf Grund dessen wurden die Glykosyltransferasen entweder mit Hilfe der porenformenden Toxin-Komponente PA des Bacillus anthracis-Toxins (Anthrax-Toxin) oder durch Verwendung des Transfer-Reagenz PROTEOfectene® in Zielzellen eingeschleust. Die Ergebnisse der Zellvergiftung zeigten, dass YkGT und YeGT eine Reorganisation des Aktinzytoskeletts bewirkten, die mit morphologischen Veränderungen (Zellabrundung) einhergingen und schließlich im Zelltod endete. Weiterhin zeigten die Versuche, dass der N-Terminus der Glykosyltransferasen sowohl für die Membrantranslokation über PA als auch für die intrazelluläre Lokalisation von Bedeutung ist.
Durch die hohe Homologie von YkGT und YeGT zu PaTox war es möglich, mit dem Server Phyre² (www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) ein Modell der Struktur von YeGT zu generieren. Anhand dieser Strukturen wurden essentielle Aminosäuren identifiziert, deren funktionelle Bedeutung durch gezielte Mutagenese in Glykohydrolase- und Glykosylierungsversuchen untersucht wurden. Die Ergebnisse zeigten, dass die Aminosäuren W28, D118, R121 sowie D134 und D136 von YeGT, die in der katalytischen Tasche lokalisiert sind, für die Glykosylierung von RhoA von Bedeutung sind. Eine entsprechende Bedeutung für die Enzymaktivität haben die Aminosäuren W44, D134, R137, D150 und D152 von YkGT. Zusätzlich wurden, anhand der Tertiärstruktur, zwei weitere Aminosäuren von YeGT identifiziert, welche essentiell für die Transferaseaktivität des Enzyms sind. Dabei handelte es sich um P206, dass vermutlich die Struktur der katalytischen Tasche definiert, und W285, welches auf dem flexiblen C-Terminus lokalisiert ist. Weitere Mutationen wurden aufgrund der Oberflächenladung der YeGT-Struktur durchgeführt. Diese Untersuchungen zeigen, dass durch Austausch der Aminosäuren E161, K260 und C278 von YeGT gegen die entsprechend positionierten Aminosäuren von YkGT das Akzeptorsubstratspektrum von YeGT dem Spektrum von YkGT angeglichen werden kann.
Zusammengefasst sind in dieser Arbeit zwei weitere Mitglieder der Gruppe von Tyrosin-glykosylierenden Toxinen identifiziert und charakterisiert worden. Aufgrund der geringen Proteingröße von YkGT und YeGT und dem Fehlen inhärenter Transportdomänen handelt es sich bei beiden Proteinen sehr wahrscheinlich um Virulenzeffektoren, die über ein noch unbekanntes bakterielles Transportsystem in Zielzellen des Wirtes transloziert werden

Angaben zum Objekt

• Standort: Deutsche Nationalbibliothek Frankfurt am Main
• Umfang: Online-Ressource
• Sprache: Deutsch
• Anmerkungen: Universität Freiburg, Dissertation, 2019

Klassifikation und Themen

• Schlagwort: Glycosyltransferasen ; Yersinia ; Yersinia enterocolitica ; Zelle ; Glykosylierung ; Yersinia enterocolitica ; Glycosyltransferasen ; Yersinia

Beteiligte, Orts- und Zeitangaben

• Ereignis: Veröffentlichung
• (wo): Freiburg
• (wer): Universität
• (wann): 2019
• Urheber: Schneider, Silvia
• Beteiligte Personen und Organisationen: Bechthold, Andreas ; Aktories, Klaus ; Albert-Ludwigs-Universität Freiburg. Fakultät für Chemie und Pharmazie

Weitere Informationen

• DOI: 10.6094/UNIFR/149773
• URN: urn:nbn:de:bsz:25-freidok-1497733
• Rechteinformation: Der Zugriff auf das Objekt ist unbeschränkt möglich.
• Letzte Aktualisierung: 14.08.2025, 10:53 MESZ