Microfluidic automation of sample preparation for mass spectrometry based proteomics

Abstract: Tandem-Massenspektometrie, gekoppelt an Flüssigchromatographie (LC-MS/MS), hat sich zu einem unverzichtbaren Werkzeug für die Proteomik entwickelt. Dies liegt vor allem an der Möglichkeit hunderte bis tausende von Proteinen in komplexen Proben mit weniger als 1 μg Gesamtproteinmenge zu identifizieren und quantifizieren. Typischerweise wird hierzu der Bottom-up Ansatz gewählt, in dem die Proteine der Probe vor der Injektion in das LC-MS/MS System in Peptide gespalten werden. Im Vergleich zu den enormen Fortschritten, die in den letzten Jahren auf Seiten der Geräteentwicklung und der Bioinformatik erzielt wurden, ist die Weiterentwicklung der Probenvorbereitung für die Bottom-up-Proteomik deutlich langsamer verlaufen. Dabei stellt die Probenvorbereitung einen essenziellen Schritt jedes Experiments dar und sämtliche nachfolgenden, hochsensitiven Analysen werden durch eine ungenügende Probenvorbereitung hinfällig. In der Bottom-up-Proteomik umfasst die Probenvorbereitung mindestens die enzymatische Spaltung (Verdau) von Proteinen in Peptide, sowie die nachfolgende Aufreinigung und Anreicherung der generierten Peptide (Entsalzung). Diese Abläufe umfassen eine Vielzahl an Schritten zur Handhabung von Flüssigkeiten und sind daher anfällig für Kontamination und Fehler. Aus diesen Gründen ist die Probenvorbereitung zu einem limitierenden Faktor bezüglich der Reproduzierbarkeit von LC-MS/MS Analysen von protein- und peptidhaltigen Proben geworden.
Die Automatisierung mittels zentrifugaler Mikrofluidik, mit deren Hilfe komplexe biochemische Abläufe hervorragend automatisiert werden können, stellt einen geeigneten Ansatz dar, um die Herausforderung der mangelnden Reproduzierbarkeit der Probenvorbereitung für die Bottom-up-Proteomik zu lösen. Diese Arbeit beschäftigt sich daher mit der Frage inwiefern die Probenvorbereitung für die Bottom-up-Proteomik von der Automatisierung mittels der zentrifugalen LabDisk Plattform profitieren kann. In der zentrifugalen Mikrofluidik wird eine Kombination von Zentrifugalkraft und weiteren Kräften für die Kontrolle von Flüssigkeiten in mikrofluidischen Chips genutzt. In den letzten Jahren wurde eine Reihe von Grundoperationen, wie etwa das Mischen, Abmessen oder Schalten entwickelt. Dies ermöglicht die Automatisierung komplexer biochemischer Abläufe auf der LabDisk Plattform.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die LabDisk Plattform genutzt um eine mikrofluidische Disk (DigestionDisk) für den tryptischen Verdau von humanem Serum zu entwickeln. Anhand des Vergleichs dreier Triplikate von humanem Serum, die jeweils entweder mit der entwickelten DigestionDisk oder anhand eines manuellen Protokolls an drei verschiedenen Tagen verdaut wurden, konnte eine exzellente Leistung des mikrofluidischen Chips demonstriert werden. Während eine vergleichbare Anzahl an Proteinen (600) mittels LC-MS/MS mit beiden Ansätzen identifiziert wurde, war der Median des Variationskoeffizienten (CV) der Proteinintensität für Proben, die mit der DigestionDisk prozessiert wurden, um 7.6% geringer. Darüber hinaus konnten unter Verwendung der DigestionDisk 17% mehr Proteine mit einem Intensitäts-CV von weniger als 30% quantifiziert werden.
Als nächster Schritt wurde die Aufreinigung und Anreicherung von Peptiden (Entsalzung) mittels Festphasenextraktion unter Verwendung der LabDisk Plattform automatisiert. Um die zentrifugalmikrofluidische Automatisierung von komplexen Abläufen mit Binde-, Wasch- und Elutionsschritten realisieren zu können, wurde eine neue Grundoperation entwickelt, die das wiederholte und bedarfsweise Dosieren einer Flüssigkeit aus einem einzelnen Reservoir in eine Kammer ermöglicht. Diese Entwicklung ermöglichte die Realisierung der DesaltingDisk. Um die Leistung der entwickelten mikrofluidischen Disk zu untersuchen, wurden Triplikate tryptischer Peptide entweder mit der DesaltingDisk oder anhand eines manuellen Protokolls entsalzt. Anhand von LC-MS/MS Untersuchungen der aufgereinigten Peptide wurde gezeigt, dass beide Entsalzungsansätze im Hinblick auf die Anzahl an Peptididentifizierungen gleichwertige Ergebnisse liefern. Untergruppen von 10444 Peptiden und 1676 Proteinen, die in jeder einzelnen Probe quantifiziert werden konnten, wurden hinsichtlich der Reproduzierbarkeit der Quantifizierung ausgewertet. Der Median des Intensitäts-CVs in Proben, die mit der DesaltingDisk aufbereitet wurden, war geringer (9.3% auf Peptidebene und 4.2% auf Proteinebene) als der Median der Proben, die mit dem manuellen Protokoll entsalzt wurden (12.6% auf Peptidebene und 5.8% auf Proteinebene).
Den Abschluss dieser Arbeit bildet die Untersuchung inwiefern eine Beschichtung mit dem Hydrophobin H*Protein B die Adsorption von Proteinen in mikrofluidischen Strukturen aus einem Cycloolfefin Copolymer (COC) minimieren kann. H*Protein B gehört zur Gruppe der Hydrophobine, bei denen es sich um amphipathische Proteine, die an hydrophilen-hydrophoben Grenzflächen stabile Monolagen ausbilden können, handelt. Für die Untersuchung wurden mikrofluidische Chips durch Eintauchen und Inkubation in einer H*Protein B-haltigen Lösung beschichtet und danach mittels eines thermodiffusiven Siegelverfahrens gesiegelt. Der verwendete Ansatz zeichnet sich gegenüber herkömmlichen Verfahren insbesondere dadurch aus, dass ein aufwändiges Beschichten indem der Chip durch den Nutzer vor Probeneingabe mit einer Beschichtungslösung gespült wird, nicht nötig ist. Die Integrität der H*Protein B Beschichtung vor und nach dem Siegelprozess wurde mittels Rasterkraftmikroskopie und Kontaktwinkelmessungen untersucht. Mittels beider Methoden konnte gezeigt werden, dass sich auf COC eine gleichmäßige hydrophile Beschichtung bildet, die resistent gegenüber Temperaturen bis zu 107 °C ist. Das Adsorptionsverhalten von Proteinen wurde für verschiedene Proben mittels Abreicherungsexperimenten in beschichteten und unbeschichteten mikrofluidischen Kanälen mit Längen bis zu 835mm untersucht. Niedrig konzentrierte proteinhaltige Lösungen (0.3 μg/mL) mit weniger als 10 ng Protein konnten mit weniger als 10% Verlust durch die beschichteten Kanäle gepumpt werden. Zusätzlich wurde die Langzeitstabilität der Beschichtung für 8 Wochen nachgewiesen.
Es wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass sich die zwei essenziellen Schritte der Probenvorbereitung für die Bottom-up-Proteomik erfolgreich mittels zentrifugaler Mikrofluidik automatisieren lassen. Dabei konnte sowohl die Reproduzierbarkeit der Probenvorbereitung verbessert, als auch der händische Aufwand minimiert werden. Darüber hinaus wurde eine mögliche Lösung für das Vermeiden der unspezifischen Adsorption von Proteinen in mikrofluidischen Strukturen entwickelt, die mit den typischen Produktionsprozessen der LabDisk Plattform kompatibel ist. Die Ergebnisse dieser Arbeit stellen somit eine hervorragende Grundlage für weitere Forschungs- und Entwicklungsarbeiten im Bereich der hochreproduzierbaren Probenvorbereitung für Bottom-up-Proteomik mit geringen Probenmengen zur Verfügung

Angaben zum Objekt

• Standort: Deutsche Nationalbibliothek Frankfurt am Main
• Umfang: Online-Ressource
• Sprache: Englisch
• Anmerkungen: Universität Freiburg, Dissertation, 2022

Klassifikation und Themen

• Schlagwort: Proteomics ; Automation ; Mass spectrometry ; Mikrofluidik ; Probenvorbereitung ; Proteomanalyse ; Massenspektrometrie

Beteiligte, Orts- und Zeitangaben

• Ereignis: Veröffentlichung
• (wo): Freiburg
• (wer): Universität
• (wann): 2022
• Urheber: Klatt, Jan-Niklas Stefan
• Beteiligte Personen und Organisationen: Zengerle, Roland ; Zengerle, Roland ; Schilling, Oliver ; Albert-Ludwigs-Universität Freiburg. Fakultät für Angewandte Wissenschaften

Weitere Informationen

• DOI: 10.6094/UNIFR/225222
• URN: urn:nbn:de:bsz:25-freidok-2252227
• Rechteinformation: Kein Open Access; Der Zugriff auf das Objekt ist unbeschränkt möglich.
• Letzte Aktualisierung: 25.03.2025, 13:53 MEZ