Enzymkatalyse im Mikroreaktor : Immobilisierung von alpha-Chymotrypsin und Ribonuklease H mittels Fluor-Fluor-Wechselwirkungen

Hochschulschrift

Zusammenfassung: In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene perfluorierte Ankermoleküle entwickelt, um Enzyme reversibel und unter Beibehaltung ihrer biologischen Aktivität mittels Fluor-Fluor- Wechselwirkungen auf perfluorierten Oberflächen zu immobilisieren. Die Ankermoleküle, deren Synthese an der festen Phase realisiert wurde, unterschieden sich dabei in ihrer Länge, um den Einfluss der Nähe zur Oberfläche auf die Beweglichkeit der Biomoleküle zu untersuchen. Der Einsatz perfluorierter Oberflächen stellt einen großen Vorteil gegenüber anderen Oberflächen dar, da Biomoleküle keinerlei unspezifische Adsorption an diese zeigen. Zunächst diente alpha-Chymotrypsin als Modell-Enzym, wobei dabei die Hydrolyse von N-Benzoyltyrosin ethylester zur freien Säure UV/Vis-spektroskopisch detektiert wurde. Zusätzlich wurde Ribonuklease H (RNase H) verwendet, die als Endonuklease spezifisch die Phosphodiesterbindungen zwischen RNA-Nukleotiden in DNA/RNA-Hybriden spaltet. Dafür wurde als Substratanalogon ein mit einem FRET (Fluoreszenz-Resonanz- Energie-Transfer)-Paar markierter DNA/RNA-Duplex synthetisiert und die katalytische Aktivität der RNase H erfolgreich über die Abnahme der FRET-Effizienz detektiert. Die Katalysen wurden unter Mikroreaktor-ähnlichen Bedingungen in perfluorierten Glaskapillaren durchgeführt. Der Abstand der Enzyme zur Oberfläche, die Flussgeschwindigkeit der Substrate durch die Kapillare und die Enzymmenge zeigten dabei einen signifikanten Einfluss auf die jeweiligen Umsätze
Zusammenfassung: Aim of the present work was the immobilization of enzymes on surfaces via the non-covalent, strong interactions between perfluorinated compounds while retaining their biological activity. To accomplish this task different anchor molecules were developed, which consist of the perfluorinated tag, a hydrophilic oligo ethylene unit as flexible spacer to accomplish a good environment for the enzymes and a dansyl derivative as chromophore for easy detection during synthesis. After synthesizing on solid support, the anchors were coupled to the enzymes by amide bond formation. Three different anchors have been established which differ in length in order to examine the influence of the proximity of the surface on the enzyme activity. As a great advantage in comparison to other surfaces, perfluorinated surfaces do not show any unspecific adsorption of biomolecules to the surface. Using the serine protease alpha-chymotrypsin as a first model enzyme, the catalytic performance was evaluated through the hydrolysis of N-Benzoyl tyrosine ethyl ester to the corresponding acid by UV/Vis-spectroscopy. As second enzyme ribonuclease H (RNase H) was used, which shows endonuclease activity by cleaving phosphodiester bonds between RNA-nucleobases of DNA/RNA-hybrids. As substrate a RNA/DNA-hybrid was designed, which was equipped with a FRET (fluorescence resonance energy transfer)-system following the enzymatic activity by decrease of acceptor emission. Enzyme catalysis were successfully carried out under microreactor conditions in perfluorinated glass capillaries with a diameter of 250 µm. Different flow rates of the substrates through the micro channel could be realized by applying syringe pump techniques. The distance between the enzymes and the surface, flow rates of the substrates and the amount of the enzyme in the capillary showed to have a significant influence on the substrate conversion

Object Details

• Location: Deutsche Nationalbibliothek Frankfurt am Main
• Extent: Online-Ressource
• Language: Deutsch
• Notes: Universität Freiburg, Dissertation, 2014

Classification and Topics

• Classification: Chemie
• Keyword: Mikroreaktor ; Enzymkatalyse ; Immobilisierung ; Fluor ; Chymotrypsin ; Proteine ; Ankergruppe ; Organische Synthese ; Gold ; Nitroglycerin ; Ribonuclease H ; Biochip ; Mikroreaktor ; Chymotrypsin ; Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer ; Enzymkatalyse ; Online-Ressource

Contributors, Places and Time

• Event: Veröffentlichung
• (where): Freiburg
• (who): Universität
• (when): 2014
• Creator: Ahrens, Anika
• Contributor: Bannwarth, Willi

Further information

• URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-95523
• Rights: Der Zugriff auf das Objekt ist unbeschränkt möglich.
• Last update: 25.03.2025, 1:53 PM CET