ThDP-dependent branching and related modifications in keto sugars of natural products : = ThDP-abhängige Verzweigung und zugehörige Modifikationen in Ketozuckern von Naturprodukten

Abstract: Verzweigtkettige Zucker gehören zur Gruppe der ungewöhnlichen Zucker, bei denen bestimmte Hydroxygruppen durch Wasserstoff, Aminogruppen oder Alkylreste ersetzt sind. Sie tragen häufig als Teil einer Glykosylierung dazu bei pharmakokinetische Eigenschaften von Substanzen zu verändern, so sind zum Beispiel die Zuckerkomponenten Desosamin und Cladinose von Erythromycin A für dessen Aktivität unerlässlich. Darüber hinaus wurden langkettige Verzweigungen (≥C2) von Ketozuckern auch in den Zellwänden von gram-positiven und gram-negativen Bakterien entdeckt. Ihre Funktion ist noch nicht vollständig geklärt, aber ihre direkte Lokalisierung in der Schnittstelle zwischen Wirt und Pathogen lässt vermuten, dass sie Virulenzfaktoren sind. Obwohl sich die verzweigtkettigen Zucker in ihrer Biosynthese hinsichtlich Nukleotidaktivierung und dem Auftreten verschiedener Desoxygenierungstufen unterscheiden, ist dieser vielfältigen Gruppe von Kohlenhydraten ein Reaktionschritt gemein: Die Verzweigungsreaktionen von Ketozuckern, die zu längeren Seitenketten (≥C2) führen, werden von ThDP-abhängigen Enzymen katalysiert. Die für die Verzweigung verantwortlichen Enzyme lassen sich in die drei Superfamilien Decarboxylasen, Transketolasen und α-Ketosäure-Dehydrogenasen 2 einteilen. In dieser Arbeit wurden Vertreter aller drei Superfamilien und ihre jeweiligen biosynthetischen Gencluster mithilfe bioinformatischer Methoden untersucht. Die daraus gewonnenen Erkenntnisse wurden genutzt, um weitere Gencluster für eine mögliche Biosynthese von verzweigtkettigen Zuckern mit Hilfe von kombinierten BLAST-Suchen zu identifizieren. Die bioinformatischen Arbeiten führten zur Entdeckung von insgesamt mehr als 150 neuen möglichen Biosyntheseclustern. Darüber hinaus wurden die identifizierten ThDP-abhängigen Enzyme hinsichtlich der Aminosäuren im aktiven Zentrum untersucht und in verschiedene Untergruppen eingeteilt. Zu diesem Zweck wurden in dieser Arbeit sowohl bereits gelöste Kristallstrukturen als auch von alphafold2 vorhergesagte Strukturen verwendet.
Die Variabilität des Zuckergerüsts ist auf C3 oder C4 verzweigte 6-Desoxy-, 2,6-Didesoxy-, 3,6-Didesoxy-, oder 2,3(4),6-Tridesoxy-Pyranosen beschränkt, die Eigenschaften der Zucker werden aber durch verschiedene Modifikationen der eingeführten Seitenkette beachtlich erweitert. Dazu gehört neben einer Reduktion der Seitenkette, die seltenere Oxygenierung, der Transfer von Acylresten und eine bisher einzigartige Transaminierung wie sie in der Biosynthese von Kibdelomycin zu finden ist. Mithilfe Genamplifikation aus der isolierten genomischen DNA aus Kibdelosporangium sp. MA7385, dem Produzenten von Kibdelomycin, wurden in dieser Arbeit Expressionsvektoren für das ThDP-abhängige Enzym KbDH und die Transaminase KbAT, die vermutlich für die Biosynthese dieser besonderen α Aminoethyleinheit verantwortlich sind, für eine heterologe Expression in Escherichia coli produziert.
KbDH, eine aus zwei Untereinheiten bestehende α-Ketosäure Dehydrogenase, wurde durch Koexpression mithilfe eines pCDFDuet-1 Vektors hergestellt. Es war hierbei ausreichend, die α Untereinheit mit einem His6-Tag zu versehen, da die Assoziation zu einem αβ-Heteromer auch mit einer nicht getaggten β-Untereinheit stabil genug war, um eine gemeinsame IMAC-Reinigung zu ermöglichen. Für beide Enzyme wurden biomimetische Ansätze im analytischen Maßstab durchgeführt, um das Substratspektrum weiter zu charakterisieren. Wie aus der Biosynthese zu erwarten, zeigte die untersuchte Aminotransferase auch Aktivität mit Substraten, die eine sterisch anspruchsvolle 3°-Alkoholgruppe in direkter Nachbarschaft aufweisen. Zusammenfassend wurde erstmals ein Überblick über die ThDP-abhängige Verzweigung von Ketozuckern auch über Vertreter der Familie der Decarboxylasen hinaus geschaffen und die Akzeptanz von nicht aktivierten Ketosubstraten in der Superfamilie der α Ketosäure Dehydrogenasen experimentell nachgewiesen. Dies erweitert die Arbeiten zu YerE und verwandten Enzymen, die für die Biosynthese von verzweigten Zuckern mit Kettenlängen zwischen C4 und C7 verantwortlich sind (ErwE, MygE und MMAR_2332), baut das Wissen über diese spezielle Substanzklasse aus und bietet somit eine breitere Grundlage für weitere Untersuchungen
Abstract: Branched-chain sugars belong to the group of unusual sugars in which certain hydroxy groups are replaced by hydrogen, amino groups, or alkyl branches. They are often providing or enhancing the pharmacokinetic properties of parent compounds, e.g., the sugar components desosamine and cladinose of erythromycin A are essential for its activity. Furthermore, long-chain (≥C2) branches of keto sugars have been discovered in gram positive and gram negative bacterial cell walls. Their function has not been fully elucidated yet, but their localisation between host and pathogen implies that they are virulence factors. Even though the branched chain sugars differ concerning their biosynthesis in e.g., their nucleotide activation or the occurrence of various deoxygenation steps, one reaction connects this diverse group of carbohydrates: The branching reactions of keto sugars that lead to longer side chains (≥C2) are catalysed by ThDP-dependent enzymes. In the process, tertiary alcohols with corresponding chiral properties are formed. These enzymes catalysing branching reactions belong to one of three enzymatic superfamilies: decarboxylases, transketolases, and α-keto acid dehydrogenases 2. In this work, representatives of all three superfamilies as well as their surrounding biosynthetic gene clusters were investigated using a variety of bioinformatics methods. Insights gained from this work were used to identify further putative biosynthetic gene clusters for the biosynthesis of branched-chain sugars using combined BLAST searches integrated in a Galaxy workflow. The bioinformatic work resulted in the identification in total of more than 150 new putative clusters. In addition, the identified ThDP-dependent enzymes were investigated concerning the residues of their suspected active site and classified into different subgroups. For this purpose, both solved crystal structures and alphafold2 predicted structures were used in this work.
Various enzymatic modifications of the introduced side chain considerably expand the variability of C3- or C4-branched sugars, which are members of 6-deoxy-, 2,6-dideoxy-, 3,6-dideoxy-, or 2,3(4),6-trideoxy-pyranoses as sugar backbones. This work summarizes enzymes catalysing different side-chain modifications found in various biosynthetic gene clusters of natural products described in literature, such as the reduction of the side chain, oxygenations, transfer of acyl moieties, and a so-far unique transamination in the biosynthesis of kibdelomycin. In this work, the ThDP-dependent enzyme KbDH and the aminotransferase KbAT presumably involved in the biosynthetic formation of this particular α-aminoethyl moiety were prepared for heterologous expression in Escherichia coli by gene amplification from the isolated genomic DNA of Kibdelosporangium sp. MA7385, the producer of kibdelomycin.
KbDH, an α-keto acid dehydrogenase consisting of two subunits, was produced by coexpression using a pCDFDuet 1 construct. It was sufficient to provide the α subunit with a His6-tag as the association to an αβ-heteromer was stable enough to conduct IMAC purification, albeit with an untagged β-subunit. Biomimetic approaches were carried out for KbDH and KbAT on analytical scales and the substrate spectrum was subsequently characterised. As expected from the proposed biosynthesis, the investigated aminotransferase also accepted substrates featuring a sterically demanding 3° alcohol moiety.
In summary, an overview of the enzymatic ThDP-dependent branching of keto-sugars beyond the superfamily of decarboxylases was established for the first time, and the acceptance of non-activated keto-substrates in the superfamily of α-keto acid dehydrogenases was experimentally demonstrated. This adds to the studies on YerE and related enzymes catalysing branching of chain lengths between C4 and C7 (ErwE, MygE, MMAR_2332) and expands the knowledge of this substance class, thus providing a broader foundation for further studies

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• Weitere Titel: ThDP-abhängige Verzweigung und zugehörige Modifikationen in Ketozuckern von Naturprodukten
• Standort: Deutsche Nationalbibliothek Frankfurt am Main
• Umfang: Online-Ressource
• Sprache: Englisch
• Anmerkungen: Universität Freiburg, Dissertation, 2022

Klassifikation und Themen

• Schlagwort: Enzymkatalyse ; Biosynthese ; Chemische Synthese ; Enzym ; Biochemie ; Enzym ; Thiamindiphosphat ; Katalyse ; Bioinformatik

Beteiligte, Orts- und Zeitangaben

• Ereignis: Veröffentlichung
• (wo): Freiburg
• (wer): Universität
• (wann): 2022
• Urheber: Krug, Leonhard
• Beteiligte Personen und Organisationen: Müller, Michael ; Pleiss, Jürgen ; Bechthold, Andreas ; Albert-Ludwigs-Universität Freiburg. Institut für Pharmazeutische Wissenschaften ; Albert-Ludwigs-Universität Freiburg. Fakultät für Chemie und Pharmazie

Weitere Informationen

• DOI: 10.6094/UNIFR/229534
• URN: urn:nbn:de:bsz:25-freidok-2295349
• Rechteinformation: Open Access; Der Zugriff auf das Objekt ist unbeschränkt möglich.