Untersuchungen zur Biosynthese der Rishirilide unter besonderer Berücksichtigung der frühen Biosyntheseschritte

Abstract: Rishirilide B ist ein aromatisches Polyketid, das durch eine Polyketidsynthase Typ II von Streptomyces bottropensis gebildet wird. Es besteht aus einer trizyklische Grundstruktur, die eine Methyl-, einer Carbonyl- sowie drei Hydroxylgruppen aufweist. Ein weiterer Substituent ist eine Isopentyl-Seitenkette, die für aromatische Polyketide ungewöhnlich ist. Der Fokus dieser Arbeit lag in der Untersuchung der frühen Schritte der Biosynthese dieses Naturstoffs.

Ein Fütterungsversuch mit der 13C markierten Biosynthesevorstufe L-Valin konnte zeigen, dass sich der biogenetische Ursprung der verzweigten Seitenkette des Rishirilide Moleküls von L-Valin ableitet. Die Umwandlung der Aminosäure in Isobutyryl CoA, eine erste Kettenverlängerung sowie eine primäre Ketoreduktion werden durch Enzyme des Rishirilide Clusters katalysiert, die zusammen mit Enzymen des Primärstoffwechsels ein sog. Initiierungsmodul bilden.

Weitere Einblicke in die frühen Biosyntheseschritte konnten durch die heterologe Expressionen früher Biosynthesegene gewonnen werden. Die alleinige Expression der minimalen PKS sowie zwei weiterer Genen des Initiierungsmoduls führte zur Produktion von RSH O10a und RSH-O10b, zwei Biosynthese-Zwischenprodukten, die durch spontane Faltung des hochreaktiven Poly-β-Ketons entstanden sind. RSH-O10a stellt das Produkt der natürlichen, C7-C12-Faltung des ersten Rings in der Rishirilide Biosynthese dar, während bei RSH-O10b ein abweichendes Faltungsmuster vorliegt. Mit dem Hinzufügen der primären Ketoreduktase RslO10 lief die Faltung des ersten Rings kontrolliert ab. Es wurde kein RSH-O10b mehr produziert, stattdessen kam es neben RSH-O10a zur Bildung eines neuen Zwischenprodukts RSH O3, das isoliert und gereinigt wurde. Die Produktion von RSH-O3 konnte auf das Fehlen von RslO3 zurückgeführt werden. Folglich wurde auch RslO3 hinzugefügt, was zur Bildung von RSH-P führte. Die Produktion von RSH-P wurde im Zusammenhang mit zahlreichen Deletionsmutanten beschrieben. Eine besonders starke Produktion konnte in der Deletionsmutante des Gens rslP nachgewiesen werden, dessen Funktion innerhalb der Rishirilide Biosynthese genauer untersucht wurde.
In silico Analysen konnten dem Enzym RslP keine eindeutige Funktion zuordnen. Das Enzym weist einerseits Sequenzähnlichkeiten zu Phosphotransferasen auf, zum anderen bestehen Ähnlichkeiten zu Acyl-CoA Dehydrogenasen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden beide putativen Funktionen von RslP untersucht. Zunächst wurde rslP deletiert und die Produktion der Deletionsmutante untersucht. Das von der Mutante produzierte Biosynthese-Zwischenprodukt RSH-P wurde isoliert und gereinigt. Ein gesicherter Strukturvorschlag konnte jedoch aufgrund von Unreinheiten nicht gemacht werden. Als mögliches Substrat von RslP in seiner Funktion als Phosphotransferase konnte RslO5 identifiziert werden. Beide Proteine wurden heterolog in E. coli produziert, isoliert und gereinigt. In dem anschließenden in-vitro Aktivitätsassay konnte eine Kinaseaktivität von RslP nachgewiesen werden, die jedoch im Verhältnis zu den eingesetzten Enzymkonzentrationen gering war. Die Untersuchung auf die Funktion einer Acyl-CoA Dehydrogenase erfolgte im Rahmen der oben beschriebenen heterologen Expression der minimalen PKS. Das Hinzufügen von RslP führte nicht zu einer Produktion weiterer potentieller Biosynthese-Zwischenprodukte.

Ein weiterer Teil der Arbeit befasst sich mit der Untersuchung der Genomsequenz von Streptomyces spinoverrucosus SNB-032. Dieser Stamm wurde in der Literatur als Produzent von Galvaquinone A und B beschrieben, die auch als Zwischenprodukte in diversen Deletionsmutanten der Rishirilide Biosynthese auftreten. Die bioinformatische Analyse des Genoms zeigte jedoch, dass S. spinoverrucosus das vollständige Rishirilide Biosynthesecluster enthält. Der Stamm wurde in verschiedenen Produktionsmedien kultiviert. Lediglich in einem verwendeten Medium war eine Produktion an Rishirilide B nachweisbar.
Zudem wurden die Extrakte aus verschiedenen Kultivierungsmedien in einem Agardiffusionstest auf ihre antimikrobielle Aktivität gegen verschiedene Mikroorganismen getestet. Vor allem der Extrakt der Produktionskultur von S. spinoverrucosus in NL111 Medium zeigte eine deutliche antibiotische Wirkung gegen die getesteten Gram-positiven sowie Gram-negativen Bakterien
Abstract: Rishirilide B is an aromatic polyketide that is produced by a polyketide synthase type II in Streptomyces bottropensis. Structurally, Rishirilide B has a tricyclic backbone including a methyl, a carboxylic acid as well as three hydroxyl groups. Furthermore an isopentyl side chain is bonded to the backbone, which is uncommon for aromatic polyketides. This work focuses on the investigation of the early biosynthetic steps of this natural compound.

Feeding experiments with the 13C-labelled precursor L-valine could prove that the biogenetic origin of the branched side chain of Rishirilide derives from this amino acid. The conversion of L-valine into the starter unit, the first chain elongation as well as a primary ketoreduction are catalyzed by enzymes of the Rishirilide gene cluster that form, together with enzymes of the primary metabolim a so-called initiation module.

Further insights in the early biosynthesis could be obtained by heterologous expression of early biosynthetic genes. Sole expression of the minimal PKS as well as two genes from the initiation module led to the production of RSH-O10a and RSH-O10b, two intermediates that result from spontaneous cyclization events of the highly reactive poly-β-ketone. RSH-O10a represents the intermediate of the naturally occuring C7-C12 folding of the first ring during Rishirilide biosynthesis, whereas RSH-O10b is cyclized in a deviant pattern. By adding the primary ketoreductase RslO10, the cyclization of the first ring proceeded in a controlled manner. No production of RSH-O10b could be detected but instead a new intermediate (RSH-O3) arised that was isolated and purified. The emergence of RSH-O3 was directly related to the absence of RslO3. Consequently RslO3 was added to the construct which led to the production of RSH-P. This compound was described in relation to various deletion mutants. Particularly, a strong production was observed in the deletion mutant of rslP. The function of this gene within the biosynthetic pathway was extensively investigated.

In silico analysis could not assign a definite function for RslP. On one side the enzyme shows sequence similarities to phosphotransferases, on the other side similarities to acyl-CoA dehydrogenases could be detected. Both putative functions of RslP were examined in this work. First, the gene rslP was deleted and the production of the resulting mutant was analyzed. RSH-P, an intermediate produced by the mutant was isolated and purified. Due to low purity it was not possible to determine the structure.
RslO5 was identified as a substrate for the putative phosphotransferase RslP. Both proteins were heterologously produced in E. coli and subsequently isolated and purified. The following in-vitro activity assay could detect a kinase acitivity for RslP. However, in relation to the applied concentrations of RslO5 and RslP, the activity was low. Investigations on the putative function of RslP as an acyl-CoA dehydrogenase were done in combination with the heterologous expression of the minimal PKS as described above. The addition of RslP did not lead to a production of further potential intermediates of the Rishirilide biosynthesis.

Another part of this study deals with the analysis of the genome sequence of Streptomyces spinoverrucosus SNB 032. This strain was described as a producer of Galvaquinone A und B that occur as intermediates in deletion mutants of several genes in Rishirilide biosynthesis. In silico analysis of the genome revealed that Streptomyces spinoverrucosus SNB-O32 harbors the complete Rishirilide gene cluster. The strain was cultivated in different production media, whereas only in one medium a production of Rishirilide B could be detected.
Moreover, the cultivation extracts were tested on their antimicrobial activity against different microorganisms in a disk diffusion test. Particularly the extracts of the cultivation of Streptomyces spinoverrucosus SNB-O32 in NL111 medium showed marked antimicrobial activities against Gram-positive as well as Gram-negative bacteria

Object Details

• Location: Deutsche Nationalbibliothek Frankfurt am Main
• Extent: Online-Ressource
• Language: Deutsch
• Notes: Universität Freiburg, Dissertation, 2019

Classification and Topics

• Keyword: Biosynthese ; Streptomyces ; Polyketide ; Naturstoff ; Cyclasen ; Isolierung ; Streptomyces ; Polyketide ; Naturstoff

Contributors, Places and Time

• Event: Veröffentlichung
• (where): Freiburg
• (who): Universität
• (when): 2019
• Creator: Schwarzer, Philipp Thomas
• Contributor: Bechthold, Andreas ; Albert-Ludwigs-Universität Freiburg. Fakultät für Chemie und Pharmazie

Further information

• DOI: 10.6094/UNIFR/149885
• URN: urn:nbn:de:bsz:25-freidok-1498850
• Rights: Der Zugriff auf das Objekt ist unbeschränkt möglich.
• Last update: 14.08.2025, 10:45 AM CEST